蛋白质的通性纯化和表征.ppt

（2）、凝胶过滤的原理 第三十页，共57页。 （二）利用溶解度差别的分离方法 影响蛋白质溶解度的主要因素： 溶液的pH 离子强度 介电常数 温度 第三十一页，共57页。 蛋白质处于PI时，净电荷为零，相邻分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀 1． 等电点沉淀和PH控制 不同蛋白质∣↓↓等电点不同∣∣ PI时溶解度最低↓将蛋白质彼此分开 第三十二页，共57页。 2．蛋白质的盐溶和盐析 中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著影响： 盐溶——低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度 在等电点时，中性盐K2SO4对一氧化碳血红蛋白的影响 第三十三页，共57页。 作用机理：蛋白质吸附盐类离子，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，蛋白质与水分子的作用加强，溶解度提高。 第三十四页，共57页。 原理－－大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来的溶液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水。降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。 盐析－－当离子强度增加到足够高时，如饱和或半饱和程度，很多蛋白质从水溶液中沉淀出来，这种现象叫盐析。 盐析法－－分离、提纯常用方法。保持蛋白质的天然构象。（NH4)2SO4 第三十五页，共57页。 血清 半饱和硫酸铵 离心 球蛋白沉淀 血清 离心 饱和硫酸铵 白蛋白沉淀 研究得最多的蛋白质之一——鸡蛋清的卵清蛋白就是用盐析法得到的： 第三十六页，共57页。 3．有机溶解分级法 如果： 那么变性问题在很大程度上可以得到解决 第三十七页，共57页。 作用原理： ①.有机溶剂的加入改变了介质的介电常数，增加了两个相反电荷之间的吸引力，蛋白质的表面可离解基团的离子化程度减弱，水化程度降低，蛋白质分子聚集沉淀。 ②.有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体的形成并沉淀。 第三十八页，共57页。 4．温度对蛋白质溶解度的影响 在40-50 °C以上，大部分蛋白质变得不稳定,开始变性，一般在中性pH介质中失去溶解力。 大多数蛋白质在低温下比较稳定,因此蛋白质的操作一般在0 °C或更低温度下进行。 在0-40°C之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增大。 第三十九页，共57页。 (三)根据电荷不同的分离纯化方法 根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类。 1、电泳 第四十页，共57页。 蛋白质的通性纯化和表征 第一页，共57页。 第一节 蛋白质的性质 一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质中的功能团　 末端α－NH2 末端α－COOH 侧链基团 所以，在某种意义上， 蛋白质的化学物理性质＝AA的化学物理性质 第二页，共57页。 　A． 蛋白质是两性电解质，能和酸或碱发生作用 B． 蛋白质分子的可解离基团来自侧链上的功能团，此外，还有少数的末端α-COOH, α-NH2 ， 若是缀合蛋白质，则在辅基成分中还可能包含可以解离的基团 C．蛋白质分子中可解离基团的pK‘和游离AA中相应基团的pK’值是完全不相同 D． 蛋白质可看作一个多价离子 带电性质和数量决定于 可解离基团的种类、数量 溶液的pH 第三页，共57页。 蛋白质等电点——对某一种蛋白质来说，在某一pH值，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷为零。这一pH称为蛋白质等电点 第四页，共57页。 短肽的等电点和净电荷量可以根据pK值计算，蛋白质的等电点要用等电聚焦等方法测定。 等电聚焦电泳：这是一种特殊的电泳，其载体上铺有连续的PH梯度的缓冲液，然后将蛋白质点样，只要该处的PH与蛋白质的PI不同，则蛋白质就会带电，PH值>PI时，蛋白质带-电；PH值<PI时，蛋白质带+电。通电后，蛋白质就会移动，直到某处的PH＝PI，蛋白质才呈电中性，不再移动，因此，可以测出PI。 第五页，共57页。 蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，会使有规则的螺旋、球状等空间结构变为无规则的伸展肽链，从而引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。 二、变性与复性 第六页，共57页。 1、变性的实质： ?次级键的断裂，所以一级结构完好 2、变性蛋白质的特点： ?生物活性丧失 ?侧链基团暴露，水溶性降低 ?易被蛋白酶水解（这就是熟食易于消化的道理） 3、变性因素： ?物理因素：加热、高压、紫外线等 ?