钻研实验四DNA回收纯化及重组体的构建.ppt

粘末端连接法 若DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末端，这将是最方便的克隆途径。同源粘性末端包括相同内切酶产生的粘性末端和不同的内切酶产生的互补粘性末端。相同内切酶产生的粘末端连接得到的重组质粒能够保留接合处的限制酶切位点，因此可以使用原来酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来。而不同酶产生的粘性末端连接得到的重组质粒不能够保留接合处的限制酶切位点，因此不可以使用原来酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来。以上两类粘性末端的连接方法都很重要。;另外，当用单酶切时，虽然产生了互补的粘性末端，但由于载体存在自连现象，也会降低正确插入的频率。通过一些处理可以减少自连现象的发生。常用的方法是用小肠碱性磷酸酶(CIP)去掉载体5?-磷酸来达到抑制DNA片段的自身环化的目的。 综上所述，在进行基因重组时，一般采用插入片段及载体两端具有两个相应的能够产生粘性末端的酶进行酶切后重组，如插入片段和载体的一端为EcoR I ，另一端为BamH I，它们都能产生粘性末端，不仅易于连接，而且又不能互补，所以能够得到较好的重组结果。;;平端连接法： 待插入片段的平末端主要由两方面来源，即由酶切后产生的平端和补平后产生的平端。一般由酶切产生的平端较易连接。但在试验过程中，往往会遇到插入片段和载体之间没有互补的末端，这时，就需要将末端进行“补平”或去除3?突出端，然后再用T4噬菌体DNA连接酶连接两个平端。不过，平端连接的效率是比较低的，一般通过提高DNA的浓度或增加连接酶的用量可提高平端的连接效率，有时也可采取在平端加上合成的接头的方法，产生粘性末端，也可以提高连接的效率 。;适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般采用载体：插入片段摩尔数为1：2-3的比例。;实验材料与仪器： PCR产物(0.8kb，带有BamHI、 HindIII酶切位点) pBluescript KS 质粒(3.0kb) NEB 1kb 标准分子量片段 BamHI、 HindIII限制酶及 10×K buffer 琼脂糖 T4 DNA ligase 及其缓冲液(Takara) TBE缓冲液(10×) 溴化乙啶染色液(10mg/ml) 上样液(3×);;电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等 ;实验方法和步骤 ;A 从PCR产物中直接回收纯化DNA (Promega 公司) 直接加100μl纯化缓冲液于1.5ml离心管，再加入30～300μl PCR反应物，Vortex混合； 加入1ml树脂轻轻Vortex 3次，每次间隔1分钟； 进入C步骤。;B 从琼脂糖凝胶回收纯化DNA 用琼脂糖凝胶分离PCR片段，用UV观察EB染色条带； 用干净的刀片切出所需DNA条带，注意要在长波长（≥300nm）UV灯下操作，并快速操作，以免损伤DNA。应尽可能多地去除琼脂糖凝胶，一次操作可切取多至300mg的条带；;将300μl (300mg) 琼脂糖条片转移至1.5ml离心管。直接在70℃温育直至凝胶全部溶化（一般可按公司提供的说明书进行）； 加1ml树脂，彻底混合20秒，但不用Vortex； 下接C步骤。 ;C 纯化步骤 将取出拉杆的注射器筒（3ml）装在纯化柱上，加入上述DNA与树脂混合液，然后装上拉杆，慢慢将混合液推进纯化柱内； 卸下注射器筒，拔出拉杆，再将注射器筒装上纯化柱，加2ml 80%的Isopropanol, 然后装上拉杆，慢慢推出液体以清洗柱子；;再次卸下注射器筒，将纯化柱装在1.5ml离心管上，10000g离心2 min，以干燥树脂； 再将纯化柱装在一个新的1.5ml离心管上，加50μl水或TE缓冲液，1分钟后，10000g离心20秒，溶出DNA片段； 移去纯化柱，将纯化出的DNA溶液在-20℃下保存备用。;D 说明 若向1ml树脂中加入500bp PCR产物50ng至16μg，其回收率可在95％以上。同样500bp，若从低溶点琼脂糖凝胶中回收其回收率在70～90％之间。;学生PCR实验结果(4?l);DNA重组 ;方法1（酶切后乙醇沉淀，适于PCR产物的重组）： 在灭菌的 Eppendorf 管中加入制备pBluescript KS空载体0.2-1μg(针对本实验，取4?l约800ng)，2 μl 10×酶切缓冲液， BamHI & HindIII酶各1μl（各5单位），用无菌双蒸水加至20μl 反应体系，于37℃保温1-3h； 在另一管中加入待插入的DNA片段（纯化的PCR产物）0.2-1μg(本实验约为4-10μl)，2μl 10×酶切缓冲液，HindIII 和 BamHI酶各1μl（各5单位），用无菌双蒸水加至20μl 反应体系，于3 7℃保温 1-3 h ；;(根据实验情况而定，完毕后各取3μl酶解液做电泳分析，观察