多克隆抗体免疫血清的制备实验报告.docxVIP

实验报告 实验名称 多克隆抗体的制备一（抗血清制备） 实验日期 院 系 专 业 班 级 姓 名 学 号 一、实验目的 了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术。 二、实验器材 试剂： 酒精棉球、NDV灭活油乳剂疫苗、麻醉剂 器材： 兔笼、注射器、剃毛剪、手术刀、止血钳、手术剪（组织剪、眼科剪）、动脉夹、眼科剪、动脉导管、纱布、棉线、细线、培养箱、冰箱、结扎细线、离心机、温箱 三、实验原理 1.机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产体液免疫和细胞免疫的过程。一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构——抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。 2.将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化 形成浆细胞并分泌特异性抗体。抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。 3.由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体。 4.多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。对于免疫原性较弱的可溶性抗原（如蛋白质类抗原）要加入佐剂，以增强免疫性。 四、实验过程及步骤 1.免疫接种 1）取一只健康大白兔固定在兔笼中 2）酒精消毒大白兔皮肤后，通过皮下或皮内注射方式接种大白兔，共计注射8-10个位置，每一处约0.1ml。 3）为提高免疫血清效价，通常需要进行2-3次加强免疫，每次免疫间隔10-15天。然后再接免疫结束后的血清采集过程。 4）注射完毕，将大白兔从兔台取下，放回饲养笼。 2.颈动脉放血 1）取一只接种过的大白兔固定于兔笼，耳缘静脉注射合适剂量的麻醉剂麻醉。将麻醉后的大白兔固定于兔台，用棉线固定四肢，细线固定门牙于铁柱，使颈部完全暴露。 2）用剃毛剪贴着皮肤减去颈部的毛，手术刀在颈部中央切开皮肤约3-4cm，纱布吸去多余的血液。用止血钳提拉住两边的皮毛，组织剪将切口扩大至7-8cm。分别剪开黏膜层、肌肉层，用止血钳扩大开口使之与皮肤一致，游离出颈动脉约2-3cm。 3）用结扎细线2根穿过颈动脉，远心端结扎，近心端备用。动脉夹夹住颈动脉近心端，用眼科镊手柄处将颈动脉抬起，然后用眼科剪斜向近心端剪开血管，插入动脉导管，两端分别用预留的结扎细线固定，打开动脉夹取血至锥形瓶后密封。 3.获得免疫血清 1）将采集的动脉血放到37℃温箱中，静置1小时。 2）在4℃冰箱内放置6-8小时，待血清析出。 3）将析出的血清转移至50ml离心管。离心管配平后，在4℃，以2000rpm转速离心5min。 4）待血清析出后，用移液器将其转移至离心管中离心，离心结束后，上层血清即为免疫血清，用移液器将其转移到离心管中，放置于-20℃冰箱冻存备用。 五、实验总结 1.多克隆抗体的制备很复杂，一般要多次间隔免疫，以便产生更多抗体。还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。 2.在暴露颈动脉的手术过程中，应保持切口在正中位置，因此固定大白兔时就要注意。为了减少出血量，因此皮肤、黏膜、肌肉要一层层剪开同时用止血钳扩开，在肌肉层最好用手指撕开，以免剪刀丰富的血管造成过量出血。 3. 放37度温箱温浴，是为了让血液内纤维蛋白原收缩，降低血清和红细胞的粘连，从而使使血清更容易与红细胞分离，不易产生溶血现象。 4. 在4℃冰箱内放置使血清析出，低温有利于稳定抗体等蛋白质的结构，防止其变性而丧失功能。 六、教师评价