蔗糖酶的分离提取及活力测定.ppt

20031021 蔗糖酶的分离提取及活力测定 课件编写制作、讲授及实验指导：郭慧云 一、目的要求 1.学习掌握3，5-二硝基水杨酸比色定糖 的原理和方法； 2.学习酶蛋白分离提取的原理； 3.学习掌握细胞破壁及抽提技术； 4.学习掌握酶活力测定及其计算的方法。 2、蔗糖酶活力测定的原理  3、蔗糖酶分离提取的原理 1）细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。材料不同，破壁的方法也不同。 我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内的物质释放出来。 自溶时需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。 自溶法的缺点是时间较长。 2）抽提： 抽提（或叫萃取）是将已破碎细胞壁的材料置于一定的条件及溶剂中，使被提取物释放出来的过程。 抽提液可用水或有机溶剂。大部分酶蛋白能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸中。对于普通的酶多采用缓冲液，有利于酶的稳定。而一些与脂质结合较牢固的酶，常用有有机溶剂提取。 抽提时缓冲液的离子强度和pH值以及温度的选择，应既有利于酶的提取又保证酶的稳定。 三、试剂和器材 （一）试剂： 1. 3,5二硝基水杨酸试剂(DNS) 4. 5%的蔗糖溶液 2. 1mol/L的 NaOH溶液 5. 乙酸钠 3. 0.2mol/L,pH4.6的醋酸缓冲液 6. 乙酸乙酯 （二）器材： 1．烧杯、搅拌棒、滴管 2. 量筒、移液管、吸耳球 3．试管、血糖管（或刻度试管）4．秒表、天平 5．冰盐浴、沸水浴 6．恒温水浴 7. 离心机、内外套管 8. 冰柜 9．分光光度计 、比色杯、镜头纸、滤纸 10. 高活性干酵母粉、硫酸纸、皮筋套 11．保温烘箱（恒温在35 ℃ 过夜） 四、操作步骤 1、蔗糖酶的分离提取：选材、破壁、提取、分离 ①自溶：10g高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中、少量多次地加入20ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.0g乙酸钠、15ml乙酸乙酯，搅匀，再于35℃ 恒温水浴中搅拌30分钟，观察菌体自溶现象。 ②抽提：补加蒸馏水20ml，搅匀，盖好，于35℃ 恒温过夜；24-36小时后，4000r/min 离心30min，弃沉淀及脂层，得无细胞提取液，量体积V=（ ）ml ；置于冷处或冰盐浴中保存，待测酶活力。  3、蔗糖酶的活力测定： ①.蔗糖酶活力的规定：在本实验条件下，每3min释 放1mg还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位。 ②.操作： 取两支试管分别加入用pH4.6,0.2mol/L的醋酸缓冲 液适当稀释过的酶液2ml，一支中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，摇匀，使酶失活（做对照），另一支做测定管； 把两支试管和5%的蔗糖溶液都放在35℃水浴中预热恒温；上述两试管中分别加入2ml 5%的蔗糖液，并准 确计算时间，3分钟后于测定管中加入 0.5ml 1mol/L的NaOH，摇匀，终止反应。 六、结果及数据处理 1.原始数据： 1）制作葡萄糖工作曲线的数据（列表） 2）葡萄糖工作曲线的K值、b值和r值 3）无细胞抽提液的体积（ml） 4）测酶活时的稀释倍数、A540值 2.数据处理： 1）蔗糖酶活力单位=葡萄糖毫克数×9×稀释倍数 2）蔗糖酶浓度=蔗糖酶活力单位/2ml [E]=葡萄糖mg数×（4.5/0.5）×E稀释倍数/2ml =（ ）u/ml 2）蔗糖酶总活力=酶浓度×无细胞提取液的体积V 总活力：[E]×V =（ ）u 七、思考题 1、简述蔗糖酶分离提取的原理及操作步骤。 2、3，5-二硝基水杨酸比色定糖法的原理及 操作注意事项。 2、用723分光光度计制作工作曲线的要求。 3、蔗糖酶活力测定的原理及两个反应。 4、在酶分离提纯的整个过程中应注意的一 个关键问题是什么？ 附：本实验的原版 蔗糖酶的分离提纯及酶促反应动力学实验 为必修、综合性大实验，讲授8学时、实验40学时 （讲授含：酶学实验和《实用正交试验方法》的上篇各4学时） 课件编写制作、讲授及实验指导：郭慧云 原版简介 1、 3，5-二硝基水杨酸比色定糖法（DNS法）工作曲线的制 作及三种蔗糖酶样品（E1、E2 、E3）酶活力的测定； 2、 Fol