动物细胞工程第四章细胞的基本培养.ppt

5、克隆培养技术 （1）稀释铺板法：使用稀释后的低密度细胞悬液，多孔培养板接种，每孔平均含1个细胞。 2)饲养层克隆法：饲养细胞常用：成纤维细胞、胸腺细胞、巨噬细胞等；较少应用。 3)胶原膜板或血纤维蛋白膜层板克隆法 ：可帮助单个细胞和极低密度细胞贴壁繁殖存活。 4)琼脂克隆法：酸性硫酸多糖可促进恶性转化细胞生长；抑制正常细胞生长。 5)多孔塑料培养板单细胞克隆法：简单易行，成功率高。低密度细胞悬液（1--2个细胞/ml）--各孔分别接种0.5--1ml。 6．细胞同步化培养：在一般培养条件下，群体中的细胞处于不同的细胞周期时相之中。为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，常需采取一些方法使细胞处于细胞周期的同一时相，这就是细胞同步化技术。 选用DNA合成抑制剂可逆地抑制S期细胞DNA合成而不影响其他细胞周期运转，最终可将细胞群体阻断在G1／S期交界处； 一些抑制微管聚合的药物，因抑制有丝分裂装置的形成和功能行使，可将细胞阻断在有丝分裂中期，即使细胞同步于M期。 A：M期同步化方法 a．振荡收集法 该法利用M期细胞变圆易脱落的特点，将贴壁细胞按一定的时间间隔振荡，使M期细胞脱落，离心沉淀后即获得M期细胞。 b．秋水仙胺阻抑法 将细胞传代培养至指数生长期；加入秋水仙胺，使最终浓度为0．05—0．1μg/mL培养基，作用6—7 h。如使用秋水仙素，使用浓度应加大5～10倍；振荡收集细胞，800 r/min离心5—10 min，收集的沉淀细胞即为M期细胞。 c．N2阻断法 ： 细胞传代培养至指数生长期，将培养瓶置于N2罐中通人适量CO2(约相当于罐中体积的5%)，关闭好N2罐，接上N2管子及压力表，缓缓向罐中充气一直到压力为80-90磅/英寸2为止，将N2装置放在37℃培养箱中10—16 h后减压，振荡法收集细胞于离心管中，800 r/min离心10 min收集细胞。 B.S期同步化方法 a.胸腺嘧啶核苷(TdR)双阻断法：该法利用过量TdR能阻碍DNA合成的原理而设计； 1．将细胞培养至指数生长期的早期。 2．加入含2 mmol/L TdR的培养基(2—2．5 mmol/L用于肿瘤细胞的同步化培养，而CHO细胞则用7 mmol/L TdR)，作用16 h。 3．弃掉TdR培养基，用Hanks液洗2—3次，再换上新鲜培养基继续温浴9 h。 4．重新加入TdR培养基(浓度同上)进行第2次阻断，作用16 h。 5．再弃掉TdR培养基，Hanks液洗2—3次后换上普通培养基。第2次TdR释放0 h时取样则细胞处于G1/S期交界处；如2-7 h取样则为不同阶段的S期细胞。 注意：具体TdR作用和释放的时间应参考每一种待同步化细胞的细胞周期各时相测定的参考值，也可根据经验确定。 C.G1期和G2期细胞的获得 1．G2期细胞的获得： 根据细胞周期测定的数值，采用TdR双阻断法使细胞同步在G1/S期交界处后，洗去TdR使细胞释放后继续培养。其培养时间应大于S期时间而小于S+G2期时间。然后先用振荡法使已进入M期的细胞脱落，弃去上清培养基；再用胰酶消化，加入新鲜培养基制成细胞悬液，离心收集细胞，即为G2期细胞。 2．G1期细胞的获得 (1)将用M期阻断法获得的细胞加入一定量的培养基，继续培养1－10 h即可获得各阶段的G1期细胞。 (2)用缺乏异亮氨酸的培养基培养细胞，培养时间超过一个细胞周期，即可获得中G1期细胞。 D.G0期细胞的获得 可采用血清饥饿法得到G0期细胞： 1．取处于对数生长期的细胞。 2．用含0．5%　-　1%小牛血清的培养基培养细胞48－72 h。或用无血清的培养基培养24 h。 3．用0．1% - 0．25%胰蛋白酶消化细胞可收获G0期细胞，可用’H-TdR掺人进行测量鉴定。 6．动物细胞的大规模培养 动物细胞大规模培养一般分为分批式操作(batch)、流加式操作(fed-_batch)、半连续式操作(semi—continuous)、连续式操作(continuous)和灌流式操作(perfusion)五种操作模式。 第四节 细胞系和细胞株的建立 一、细胞系和细胞株的种类 1．初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。 2．细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系(finite cell line)；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系(infinite