非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 团 体 标 准 T/CVMA 5—2018 非洲猪瘟病毒实时荧光PCR 检测方法 Real-time PCR assay for detection of African swine fever virus 2018 - 10 - 24 发布 2018 - 10 - 24 实施 中 国 兽 医 协 会 发 布 T/CVMA 5—2018 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中国兽医协会提出并归口。 本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心、中国兽医药品监察所、中国农业科学院哈尔滨兽医 研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、北京海关。 本标准主要起草人：倪建强、王传彬、王琴、仇华吉、殷宏、杨林、辛盛鹏、刘艳华、刘洋、宋晓 晖、赵启祖、罗玉子、刘志杰、张乾义、乔彩霞、夏应菊、杨吉飞、徐璐、顾小雪、亢文华、李硕、毕 一鸣。 I T/CVMA 5—2018 非洲猪瘟病毒实时荧光PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实 验室生物安全等技术要求。 本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 试剂 3.1 DNA 提取试剂 DNA提取试剂的配制见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。 3.2 2 × PCR 缓冲液 2 × PCR缓冲液的配制见附录A。 3.3 引物探针 3.3.1 采用针对非洲猪瘟病毒VP72 基因 （核苷酸序列见附录B ）的引物及探针： 上游引物ASF-CADC-rPCRF ：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3' 下游引物ASF-CADC-rPCRR ：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3' 荧光探针ASF-CADC-Probe ：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3' 3.3.2 可以使用世界动物卫生组织（OIE ）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals ）第2.8.1 章African Swine Fever 中提供的引物和探针，并按照手册 中规定的检测程序和判定标准操作 ： 上游引物ASF-OIE-rPCRF ：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3' 1 T/CVMA 5—2018 下游引物ASF-OIE-rPCRR ：5'-1857-ACGGCNGATCTTGTGGTATC-1876-3' 荧光探针A