H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RTPCR检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 团 体 标 准 T/CVMA 13—2018 H7N9 亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR 检测方法 Duplex real-time RT-PCR assay for detection of avian influenza A (H7N9) virus 2018 - 10 - 24 发布 2018 - 10 - 24 实施 中 国 兽 医 协 会 发 布 T/CVMA 13—2018 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中国兽医协会提出并归口。 本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心 本标准主要起草人：刘玉良、王传彬、宋晓晖、吴佳俊、杨林、孙明、陈西钊、乔明明、蒋菲、顾 小雪、刘洋、张硕、韩焘、赵柏林。 I T/CVMA 13—2018 H7N9 亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测试剂、仪器设备、实验操作步骤。 本标准适用于禽组织、分泌物、排泄物和培养物中H7N9亚型禽流感病毒检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 试剂 3.1 RNA 提取试剂 RNA提取试剂详见附录A.1～A.4 ，或选取商品化的病毒RNA提取试剂盒。 3.2 5 ×RT-PCR 缓冲液 Tris base 15.14 g KCl 13.98 g MgCl .6H O 1.53 g 2 2 DTT 3.86 g 加无核酸酶灭菌蒸馏水至400 mL ，调pH 值至8.3 （室温下），定容至500 mL 。过滤（0.22 μm ） 除菌后置于2 ℃～8℃保存备用。 3.3. 10 × PCR缓冲液的配制 Tris base 6.06 g KCl 18.64 g Triton X-100 5.00 mL 加无核酸酶灭菌蒸馏水至400 mL ，用HCl调pH值至9.0 （室温下），定容至500 mL 。高压灭菌冷却 后置于2 ℃～8℃保存备用。 3.3 引物和探针 1 T/CVMA 13—2018