华中农业大学研究生近代生物学研究技术-小宝典.pdfVIP

1.三亲本杂交：实验中，将供体菌、协助菌与受体菌混合起来，使菌体细胞紧密接触， 供体中的质粒可以在协助菌的帮助下通过接合转移方式导入受体菌中。由于所用供体 质粒中不含转移基因tra，所以，该接合转移必须有辅助菌株E.coli 参加才能完成(辅助 菌株中含tra 基因) ，因此该接合转移过程称为三亲本杂交。 2. 电转化原理、影响因素： 原理：电穿孔法即是在外加短时强电脉冲时，在细胞膜双脂层上形成瞬时微孔，使细 胞膜的通透性增强，DNA 等大分子得以进入细胞的一个生物物理过程。其细胞学原理 是细胞处于电场中时，细胞膜起着电容器的作用。电流不能通过，随着电压升高，细 胞膜组分被极化，并在细胞膜两边产生电位差。当电位差超过某一临界水平，细胞膜 局部被击穿，形成一瞬时的孔洞，孔径大小足以让大分子物质进出细胞。只要电场强 度和脉冲时间不超过临界限度，这种通透性就是可逆的。 影响因素：⑴电学因素：当电容值固定时，转化子数目随电场强度升高而增加；在适 当电场强度下，使用较大电容或电阻，则转化频率提高。但同时细胞存活数下降。⑵ 电介质：介质的离子强度影响脉冲时间，强度高则脉冲时间短，应采用低离子强度的 电介质，避免转化时存在高盐浓度。⑶DNA 浓度：转化细菌时，质粒DNA 浓度在一 定范围内，浓度增高与获得的转化子数量显线性关系。DNA 浓度超过一定范围，则转 化子数目的增加趋于饱和。⑷菌种及生理状态：①细菌中Gram 阴性细菌比厚壁的阳性 菌易于转化，真核细胞电穿孔的电场强度比细菌高；②转化效率和细胞的存活率与细 菌的生长阶段有关。对于多数细菌来说，在对数生长期，细胞对电场敏感，电激后细 胞死亡率高，但存活的细胞易于接受外来DNA ，所以用对数中期的细胞较为适宜。另 有少数Gram 阳性菌则培养到稳定器时易于转化。 3.质粒快速检测法： 原理：不经抽提纯化等步骤，直接在凝胶点样孔中将质粒从菌体中分离：菌体先加溶 菌酶和RNA 酶，在冰上裂解菌体。再将已裂解点入含有SDS 凝胶带的琼脂糖凝胶中。 SDS 在碱性条件下沉淀菌体蛋白和带组蛋白的染色体碎片，沉淀留在点样孔中。质粒 DNA 不带蛋白质，得以释放，在电场作用下进入凝胶。 注意事项：①供试菌株要充分活化，收集菌液不宜太浓；②裂解液添加适量，裂解时 间在半小时以上，至菌液变清亮后方可点样；③在较低室温下操作；④避免剧烈抽吸、 震荡、高温；⑤点样时不要有气泡，不要溢出点样孔。 4.光学显微镜性质： ⑴放大倍数：与透镜的焦距成反比，与光学筒长成正比； ⑵工作距离：物镜下透镜的下表面与载片物像的距离。物镜放大倍数愈大，工作距离 愈小； ⑶焦距：平行光线经透镜折射后的汇聚点与透镜中心的距离； ：其大小与显微镜的分辨率有关； ⑷数值口径（NA ） ⑸焦深：物镜视野中能清晰观察到物像的垂直范围。一般随物镜放大倍数增加而减小； ⑹分辨力：指分辨物体最小间隔的能力； ⑺色差：系白色光经透镜后各单色光焦点不一致的现象，一般可用一个含钙的双凸透 镜和外包两个含铅的单凸透镜组成的消色差透镜校正； ⑻球面像差：系入射透镜中部和边缘部分的光线折射后在不同的点上聚焦而产生，可 用含多组透镜的消错透镜来校正； ⑼像散：系透镜在成像过程中使物像在水平或垂直轴面上产生分散的现象； ⑽慧形像差：系透镜在成像过程中产生慧形拖尾的现象； ⑾像场弯曲：系透镜在成像过程中发生的像场弯曲的现象； ⑿ 畸变：系透镜在成像过程中产生畸形像场的现象。 4.相差显微镜原理、优点及使用方法： 原理：相差显微镜一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差） 转化为光强差的特种显微镜。相差显微镜与普通显微镜主要不同之处在于用环状光栏 代替可变光栏，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴调中望远镜及滤色片。 这些特殊装置能使活细胞或末经染色的标本中各部分的折射率或厚度的微小差异，产 生相位差，然后利用光的衍射和干涉的原理，把相差变成振幅( 明暗)之差，使人的肉眼 能够辨认出来。相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下 的生长、运动、增殖情况及细微结构的观察。 使用方法：①.依次将物镜换为相差物镜，聚光器换为相聚光器，并升至最高位置， 并在视场光阑处加上黄绿色滤光片。②.将活体标本放在镜台上，把相聚光器调至10 处， 用 10×相差物镜观察并调节至物像清晰。③.将目镜换成合轴调整望远镜，把上透镜适 当旋出并调节使相板上的亮环与暗环准确聚焦。④.调节相聚光器两侧的调节旋钮（或 插入式调节杆），使亮环准确的与暗环重合。⑤.将合轴调整望远镜重新换为目镜进行低