常用分子生物学技术的原理及其应用讲义-生物化学与分子生物学.docxVIP

常用分子生物学技术的原理及其应用

1.掌握印迹技术的概念；PCR技术的概念、原理；DNA序列测定的概念；生物芯片的概念；蛋白质分离纯化的主要技术所依据的蛋白质理化性质。

2.熟悉印迹技术的种类；实时PCR技术的原理和用途；生物芯片的用途；蛋白质分离纯化的主要方法。

3.了解蛋白质分离纯化的主要方法的基本原理；蛋白质相互作用分析的主要方法和意义；DNA序列测定技术的类型；分子生物学技术在医学发展中的意义。

第一节分子杂交和印迹技术

一、分子杂交与印迹技术的原理

分子杂交（molecularhybridization）指的是不同的DNA分子或RNA分子之间，或DNA分子与RNA分子之间，按照碱基互补配对的原则，两条完全或不完全互补的多核苷酸链相互结合，形成杂交分子的过程。

印迹技术是将待检测的生物大分子转移到固定基质上，再通过分子杂交，使其得到显现的过程。通过印迹技术不仅能够检测DNA分子或RNA分子，还能够利用抗原、抗体相互识别结合的特点，对蛋白质分子进行检测。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，即印迹技术。

探针（probe）指的是带有特殊可检测标记的多聚核苷酸片段，放射性核素、生物素或荧光染料可以标记其末端或全链的已知序列，探针可以与固定在硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜上的核苷酸互补结合，可以用于检测核酸样本中存在的特定基因。

二、分子杂交和印迹技术的类别及应用

DNA印迹（Southernblotting）用于克隆基因的酶切图谱、基因组中某一基因的定性及定量、基因突变、基因拷贝数及限制性片段长度多态性分析等。

RNA印迹（Northernblotting）用于RNA的定性定量分析。

蛋白质印迹（Westernblotting）用于蛋白质定性定量及相互作用研究。

第二节PCR技术的原理与应用

聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是模拟体内DNA复制的过程在体外获得大量DNA的技术。

一、PCR技术的基本原理

以待扩增的DNA分子为模板，用两条寡核苷酸片段作为引物，分别在拟扩增片段的DNA两侧与模板DNA链互补结合，提供3′-OH末端；在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成两条新链的合成。不断重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。

PCR体系的基本组成成分：模板（DNA双链）；引物（上游引物及下游引物）；原料（四种dNTP）；耐热的DNA聚合酶；Mg2＋缓冲液。

PCR基本反应过程包括变性、退火、延伸。

二、PCR技术的主要用途

1.获得目的基因片段在人类基因组计划完成之前，PCR是从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的新基因片段或新基因的主要方法。目前，该技术是从各种生物标本或基因工程载体中快速获得已知序列目的基因片段的主要方法。

2.DNA和RNA的微量分析PCR技术的敏感性高，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量定性和定量分析的最好方法。理论上讲，1滴血液、1根毛发或1个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此，在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。

3.DNA序列分析将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度，是实现高通量DNA序列分析的基础。待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。

4.基因突变分析PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性，例如单链构象多态性分析、等位基因特异的寡核苷酸探针分析、基因芯片技术、DNA序列分析等。

5.基因的体外突变在PCR技术建立以前，在体外对基因进行各种突变是一项费时费力的工作。现在，利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行插入、嵌合、缺失、点突变等改造。

三、几种重要的PCR衍生技术

逆转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。

原位PCR技术是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的基因片段。PCR反应在福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行。反应后，再用特异性探针进行原位杂交即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在，原位PCR将目的基因的扩增与定位相结合，既能分辨鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置。

实时PCR（real-timePCR）技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时PCR技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。目前，临床上有较广泛的