5-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳.pptVIP

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）电泳1.带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis)2.利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide,Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)。与其他凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：(1)在一定浓度时，凝胶透明、有弹性、机械效能好。(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学作用。(3)对pH和温度变化较稳定(4)几乎无电渗作用，只要纯度高，操作条件一致，样品分离重复性好。(5)样品不易扩散，且用量少，灵敏度可达1ug。(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而叫醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。PAGE应用范围广，可测定蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量极少量的制备，还可测定分子量、等电点等。聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类，前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中流动不仅有电荷效应、分子筛效应、还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度和分辨率均较前者佳。影响蛋白质迁移的主要因素蛋白质分子量大小蛋白质形状蛋白质所带电荷SDS的作用SDS是一种有效的变性剂，能断裂分子内和分子间氢键及疏水作用，破坏蛋白质的二级和三级结构，导致蛋白变性，随后与SDS分子按比例结合，由于SDS带有大量的负电荷，该电荷量远远超过了蛋白质原有的电荷量，因此蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用SDS-蛋白质复合体改变了蛋白质单体分子的构象，形成了近似雪茄形的长椭圆棒，消除了蛋白质原有形状的差别当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。符合如下方程式：LgMW=－b?mR+K其中，MW为蛋白质的分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量操作过程1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个干净的小烧杯

2.把玻璃板装入主体，用楔形插板夹紧，将主体放入制胶器内，旋转手柄夹紧主体

分离胶(12%10ml)浓缩胶(5%4ml)ddH2O3.4ml2.44ml30%Acr4.0ml520μlBuffer1.5mol/LpH=8.8Tris-HCl2.5ml1mol/LpH=6.8Tris-HCl1ml10%SDS100μl40μl10%Ap100μl40μlTEMED11μl5μl配胶3.按比例配好分离胶,用滴管快速加入,大约5厘米左右,之后加少许水,静置至胶凝

*凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡*水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡

*胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面

4.倒出并用滤纸把剩余的水吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至上缘,迅速插入梳子,静置到胶凝

*梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平5.将主体从制胶器上取下，放入电泳槽中。先在内槽中加入缓冲液，再在电泳槽中倒入缓冲液，拔出样梳6.上样：（1）marker15μl（2）样品10ul100℃沸水浴，3-5min（以除去亚稳态聚合）8.接通电源，进行电泳，开始电流恒定在150V，停止电泳

9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，染色5分钟左右

10.脱色：染色后的凝胶板用