重组DNA-分子克隆技术课件.ppt

重组DNA-分子克隆技术5.免疫学方法利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选。包括：免疫化学方法、酶免检测法放射性抗体检测法滤膜（固定抗体）+第6步：克隆基因的表达1.表达载体的选择和构建2.受体细胞的建立和转化3.目的基因的表达及检测4.表达产物的分离和纯化5.表达产物的应用1.表达载体的选择和构建（1）表达载体的选择①原核表达体系大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系，运用大肠杆菌表达载体符合下述标准：※含大肠杆菌适宜的选择标志※具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子※含适当的翻译控制序列和翻译起始点等※含有合理设计的多接头克隆位点，以确保目的基因按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处：※由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA※由于缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰※表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理※很难表达大量的可溶性蛋白。2．真核表达体系与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优势性。尤其是哺乳类动物细胞，不仅可表达真核的cDNA，而且还可表达真核基因组DNA；将表达载体导入真核细胞的过程称转染，常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导转染、电穿孔法、脂质体转染及显微注射。4．聚合酶链式反应（PCR）：在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向DNA合成体系中引入热稳定的TaqDNA聚合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合成，使目的基因按指数增长。※变性、退火、延伸三步曲变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的DNA链每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得230（1.07×109)个基因片段5、几种重要的PCR衍生技术※反转录PCR技术※原位PCR技术※实时PCR技术PCR扩增结果实例第2步：克隆载体的选择1.质粒：存在于细菌染色体外，小型闭合环状双链DNA分子，可独立自主进行复制，含筛选标记，含多种限制性内切酶的单一切割位点，可插入目的基因。2.噬菌体：λ噬菌体、MB载体。可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。3.柯斯质粒与酵母人工染色体载体：用于插入大DNA片段。4.病毒载体：TMV，CaMV，PVX等，瞬时表达常用。※病毒增殖水平较高,??可使伴随的外源基因高水平表达；※病毒增殖速度快,??外源基因在很短时间(通常在接种后1~2??周内)可达最大量的积累；※病毒基因组小,??易于进行遗传操作,??大多植物病毒可以通过机械接种感染植物,??适于大规模商业操作;??※宿主范围广,??一些病毒载体能侵染农杆菌不能或很难转化的单子叶、豆科和多年生木本植物,??扩大了基因工程的宿主范围;??※病毒颗粒易于纯化,??可显著降低下游生产成本。所以植物病毒是外源基因的瞬时高效表达载体。第3步：外源基因与载体的连接即DNA的体外重组。这种DNA重组是靠DNA酶将外源DNA与载体共价连接的。1．粘性末端连接(1)同一限制酶切割位点连接由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。那么，当这样的两个DNA片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。(2)不同限制酶切割位点连接由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段，具有相同类型的粘性末端，即配对末端粘端连接CCGGCCGGGGCCGGCCCGGCCGGCCGGCCGGCCCGGGGCCHapⅡT4-DNA连接酶HapⅡ2．平端连接※限制性内切酶作用