常见动物源性成分快速测定膜芯片法国家标准编制说明.docVIP

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《常见动物源性成分快速测定膜芯片法》

国家标准征求意见稿

编制说明

标准起草小组

二○一七年七月六日

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目录

1.概况

1.1任务来源

1.2标准起草单位

1.3工作概况

2.背景及研究现状

2.1动物源成分检测研究概况

2.2主要检测方法

2.3膜芯片的来源与检测原理

3.标准编制原则

4.标准编制依据

5.标准制定过程

5.1标准基本框架及预研

5.2提交标准草案

5.3国家标准立项

5.4国家标准验证

5.5形成标准征求意见稿

6.实验过程及参数确定

6.1动物源性成分检测膜芯片点阵

6.2PCR反应使用的引物序列

6.3目标基因探针序列6.4多重PCR反应体系

6.5PCR反应参数

6.6膜芯片杂交

6.6.1杂交体系配制

6.6.2酶孵育体系配制

6.6.3膜芯片杂交6.6.3.1手动杂交

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6.6.3.2自动杂交

6.7膜芯片的结果判读

7.方法效果实验评估

7.1特异性评估

7.2可重复性和可再现性评估

7.3灵敏度评估

7.4稳定性评估

7.5实际样品测试

7.6验证

7.6.1验证单位

7.6.2验证结果

7.6.2.1假阴性和假阳性结果测试

7.6.2.2灵敏度和重复性结果测试

8.结论

8.1验证结论

8.2验证样本

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《常见动物源性成分快速测定膜芯片法》国家标准征求意见稿

编制说明

1.概况

1.1任务来源

本国家标准的制定是根据国家标准化管理委员会：《关于下达2017年第一批国家标准制修订计划的通知》的通知：项目名称：“常见动物源性成分快速测定

膜芯片法”,项目编号T-424,计划执行日期为：2017-2018年。

1.2标准起草组

本标准起草单位包括中国标准化研究院、四川华汉三创生物科技公司、山东省食品药品检验研究院、安徽省食品药品检验研究院、安徽出入境检疫检验局、滨州市食品药品检验检测中心、成都市食品药品检验研究院、江西省食品药品检

验研究院、上海市兽药饲料检测所等。

1.3标准概况

在动物源性成分的测定中，已制定一系列国家标准：GB/T25165-2010明胶中牛、羊、猪源性成分定性检测方法实时荧光PCR法；GB/T21101-2007动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR法。基于核酸的检测方法和基于蛋白的检测方法是目前检测动物源成分的两种主要方法。传统的PCR方法存在检测效率低、假阳性高、易污染、成本高的缺点，很难满足批量大、高效快速的检验要求。而荧光PCR虽然检测速度较快，但是每次反应只能检测1-3种指标，指标较少，对于盲样检测，检测成本较高。相对于现行标准中公布的检测技术，膜芯片方法可以在进行多指标并行检测的同时，实现快速、灵敏、方便、成本低、准确、高

通量、自动化、低假阳性和可视化的动物源成分测定。

在制定本标准时参阅了国内外DNA的提取技术、样品制备及相关的国家标准、应用及测定有关的技术文献和分析方法，确定本方法的基本原理和试验技术

流程。

2.背景及研究现状

2.1动物源成分检测研究概况

我国是禽畜产品生产和消费大国。食品及饲料中动物源性成分的检测关系食

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品安全和畜牧业安全。近年来，市场上屡次出现不法分子在肉制品中掺杂掺假现象，更有甚者使用腐烂变质进行掺假，严重损害消费者权益甚至会影响食品安全。同时，在畜牧业生产中，为防止疯牛病发生，我国也出台相关法律禁止在反刍动物饲料中添加动物源性成分，因而，饲料中动物源性成分的检测也是防止疯牛病有效环节。目前国内外对于动物源性成分的检测报道主要有显微镜检法、红外光谱法、ELISA、普通PCR、荧光定量PCR等方法，这些技术一般每次仅能检测一种或两种指标，无法同时分析检测食品中所涉及的多种动物源性成分，这些方法不能很好满足快速、大规模、高通量检测的需求。而基因芯片技术目前绝大多数还处于实验室阶段，更多的用于基础性研究。目前基因芯片法一般采用玻璃片作为固相支持物，实验过程需要相应的点样仪和芯片识读仪，成本较高。因此研发一种快速、方便、灵敏度高、成本低、可视化和高通量的检测方法将具有非常好的应用前景及市场推广力。本方法根据市场中常见禽畜产品中主要动物源性成分(包括猪、黄牛、羊、鸡、鸭、兔、驴、貂、狐、鼠、牦牛等)中的线粒体/核基因组基因物种特异性片段设计制成特异多重PCR引物和杂交探针，将PCR产物与膜芯片上固定排列的探针进行杂交，可一次性对样品的中多种动物源性成分进行筛检，单次反应检测基因的数量将得到很大提高，能克服动物源性成分检

测的核心问题，极大地降低检测成本和工作量，提高检测效率和准确性。其技术

优势如下：1)操作简单