临床免疫学与检验课件：免疫组织化学技术.ppt

应用： 细胞表面成份的研究 胶体金技术与冷冻蚀刻技术结合-细胞膜蛋白颗粒或其它膜成份进行精细定位 电镜原位杂交技术，能够在超微水平上精确定出基因位点 免疫胶体铁细胞化学染色法 胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。 酶免疫电镜技术 酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。 第六节 免疫组化技术的应用 一、免疫组织化学技术的临床应用 第三节 酶免疫组织化学技术 定义:是在一定条件下，应用酶标抗体(抗原)与组织或细胞标本中的抗原(抗体)发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜识别标本中抗原(抗体)的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。 一、组织处理 常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片等，其固定及标本制作方法见第一、二节。与荧光免疫技术相比，酶免疫组织化学技术具有染色标本可长期保存，可用普通光镜观察结果，可观察组织细胞的细微结构等优点。 二、酶标记抗体免疫组化染色 定义:借助交联剂的共价键将酶直接连接在抗体上，酶标抗体与靶抗原反应后，再通过对底物的特异性催化作用，生成不溶性有色产物，达到对抗原定性、定量、定位检测的目的。 常用的方法: 直接法 间接法 三、非标记抗体酶免疫组化染色 特点: 用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体 酶通过免疫学反应与抗酶抗体及组织抗原上的第一抗体结合，最后经酶分子催化底物的显色反应，达到对抗原的检测 避免了酶标记抗体对抗体的损伤，提高了方法的敏感性 技术类型 酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过第二抗体作桥抗体，将结合在组织抗原上的第一抗体与第三抗体连接起来，最后形成酶联的抗原-抗体复合物，底物显色 + + + HRP 底物 二抗/Ab2 兔源一抗/Ab1 Ag 兔源抗酶抗体/Ab3 Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP复合物 Ag Ag Ag Ag 优点： 敏感性较酶标法有所提高 缺点： 操作分四步，较复杂 如果抗酶抗体与酶结合弱，在操作中酶常被冲洗掉 如果酶标记在非特异性抗体上会存在背景着色问题 如果抗酶抗体的非特异性成分与桥抗结合，结果就与抗酶 抗体竞争桥抗的结合位点，也会影响方法的 敏感性 PAP法：是酶桥法的改良法。PAP法将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶形成一种稳定可溶性(PAP复合物) + + + 底物 二抗/Ab2 兔源一抗/Ab1 Ag 兔源PAP复合物 Ag Ag Ag Ag-Ab1-Ab2-PAP复合物 特点: 操作只需三步 PAP复合物稳定，酶不易洗脱，避免了酶桥法的弊端 桥连抗体存在的非特异性抗体，不能与抗酶抗体结合 抗酶抗体中存在的非抗酶抗体不能与酶结合，不会有酶活性，因而大大减弱背景着色 双桥PAP法 基本原理:是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上。这种放大方式由于重复使用桥抗体，使桥抗与PAP复合物中的抗酶抗体未充分饱和的Fc段结合，或桥抗体与特异性一抗尚未饱和的Fc段结合。对抗原有明显放大作用，对于组织细胞微量抗原的检测更有实用价值。 APAAP法：有些组织细胞富含内源性过氧化物酶，染色时就不宜使用HRP体系。用碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶(AP)-抗碱性磷酶(AAP)法，简称APAAP法 + + + 底物 二抗/Ab2 兔源一抗/Ab1 Ag 兔源APAAP复合物 Ag Ag Ag Ag-Ab1-Ab2-APAAP复合物 四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物 常用种类: 辣根过氧化物酶/HRP 底物显色棕色或灰蓝色 最常用 碱性磷酸酶/AP 底物显色玫瑰红色或深蓝色 最敏感 葡萄糖氧化酶/GO 底物显色蓝色 敏感性较低，显色底物不易保存 β-半乳糖酶等 酶的选择: HRP染色结果比AP染色结果保存时间长 含有内源性HRP的组织切片:首选标记酶为AP AP和HRP结合可进行双重或3重免疫组化标记,对比清晰 第四节 亲合组织化学染色 亲和组织化学（Affinity histochemistry）是利用两种物质之间的高度亲合力而建立的一种方法。一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素、生物素和葡萄球菌A蛋白等，都对某种组织成分具有高亲和力的特点，可以与标记物如荧光素、酶、同位素、铁蛋白及胶体金等结合,可采用荧光显微镜、酶加底物的显色反应、放射自显影或电子显