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利用紫外吸收光谱检查物质的纯度 导读：新冠疫情的爆发加速了mRNA疫苗技术的产业化，mRNA技术是生物制品的一大突破。作为一种应用于临床的创新型技术，mRNA工艺路线的开发和放大必须借助于成熟的质量分析方法，以确定mRNA的纯度、完整性、粒径、分散系数、高级结构以及其他关键质量参数，才能确保mRNA疫苗或药物的批间稳定性，确保其安全性和疗效。2023 年 2 月 14 日，伦敦帝国学院的Robin J. Shattock教授作为通讯作者在Biology Methods Protocls发表文章：《Biophysical characterization of the structure of a SARS-CoV-2 self-amplifying RNA (saRNA) vaccine》。研究者采用紫外（UV）光谱、毛细管电泳（CE）、生物小角X射线散射（BioSAXS）、动态光散射（DLS）和圆二色谱（CD）来表征新冠自复制mRNA疫苗的纯度、完整性、粒径、分散系数、高级结构等关键质量属性。 菌菌以Robin报道的mRNA检测项和质量分析方法为主题，同时补充查询了相关的检测原理，整理输出本系列文章供大家参考。今天的文章，菌菌将分享mRNA浓度和纯度检测的基础方法——紫外光谱法。 一、紫外光谱法的原理和应用范围 紫外光谱法，也称紫外分光光度法，检测原理同紫外-可见分光光度法。紫外-可见分光光度法是在190～800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。其中波长在400nm以上属于可见光范围，波长400nm以下属于紫外线范围。 紫外光谱法的检测样品一般为成分均一的溶液。当紫外线穿过被测样品时，一部分光被样品吸收，一部分透过，基于光学元件检测样品的透光度、吸光度。对于同一种物质来讲，吸光度的影响因素主要为检测波长和样品浓度。 采用紫外光谱法对样品进行定量检测时，我们首先要确定其吸收光谱。通过测定样品在不同波长处的吸光度，绘制其吸光度与波长的关系图，我们就得到了样品的吸收光谱。从吸收光谱中，我们能够确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin。最大吸收波长λmax下，在一定浓度范围内，样品浓度与吸光度呈线性关系。基于标准曲线，我们可计算得到样品浓度。 此外，紫外光谱法还可用于物质的鉴别，可选择的方法有以下几种：①通过比较特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱；②通过测定最大吸收波长；③通过测定两个特定波长下的吸光度比值。 紫外光谱法的应用场景包括专用于吸光值检测的紫外-可见分光光度计，直接检测核酸（DNA或RNA）样品、菌液样品，无需进行显色反应；或经一步或多步显色反应后，以整个反应体系为样品检测吸光度，如蛋白浓度检测、酶活性检测等。紫外光谱还可作为一种元件整合于其他检测设备，如AKTA核酸/蛋白纯化设备、HPLC检测设备，以捕捉样品的特异性信号。 图1：分光光度计的检测原理示意图 二、紫外光谱法检测mRNA浓度和纯度 紫外光谱法已经广泛用于RNA浓度和纯度测定。文章作者绘制了自复制mRNA疫苗的UV光谱。结果显示，该mRNA样品的最大吸收波长λmax为260nm，在260nm处的吸光度记为A260，一般采用A260用于mRNA的定量检测。mRNA纯度检测主要关注3个波长处的吸光度，一个是260nm，另外两个检测波长为280nm和230nm，其中280nm处为蛋白、苯酚等杂质，230nm处为EDTA、糖类、酚类杂质。 A260/A280与A260/A230的比值是核酸纯度的重要参考指标。对于RNA样品，A260/A280比值等于或大于2则表示纯度非常高，比值小于2.0则表明RNA中存在蛋白、苯酚或其他在280nm波长附近有吸收峰的杂质。另外需注意的是，RNA溶液pH的变化可能会导致A260/A280比值的波动。酸性溶液会导致A260/A280比值降低0.2-0.3，而碱性溶液会导致A260/A280比值增加0.2-0.3。 A260/A230比值也常常用来表征核酸纯度。对于高纯度的核酸来说，其A260/A230比值常常比A260/A280更高。一般来说，理想的A260/A230比值应该在2.0-2.2，如果A260/A230比值太低，说明存在其他在230nm附近有吸收峰的杂质，例如，EDTA、糖类、酚类。 图2：自复制mRNA疫苗的?UV?光谱 三、结论紫外（UV）光谱法是测定mRNA浓度和纯度的经典方法，可以快速测定 RNA 样品浓度和蛋白质污染水平。UV光谱法的缺陷在于，仪器间的差异会导致结果的不一致，可能影响分析方法的成功转移。因此，仪器校正和检定、吸光度准确度、杂散光检查应符合《中国药典2020版》规定。基于全面的设备设施保障、先进多元化的检测方法及严格的质控放行标准，耀海生物核酸药