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外源蛋白在现代生物学中的应用 基于遗传、生物学、生物化学和微生物科学的发展，互补基因工程技术（也称为重建dna技术）在20世纪70年代初出现。该技术通过在体外将核酸分子插入质粒、病毒或其他载体分子,构成遗传物质的新组合,并将其导入宿主细胞内,继而在新的遗传背景下得到稳定扩增及表达。 重组蛋白表达技术是研究蛋白质功能、结构,以及筛选靶向药物的有力工具,在基础科学以及医药学领域发挥了重要作用。本文对一些常见的外源基因表达系统(包括原核、真核表达系统)的优缺点进行了综述,并对其最新的研究进展进行了简要的概括,以期对我们实验过程中如何选择表达系统,提高蛋白产量有所帮助。 1 基础表系统 1.1 tkis对外源基因表达的影响 1977年,Itakura等成功地在E.coli中表达了一种哺乳动物的肽类激素-生长激素抑制素,从而首次实现了外源基因在原核细胞中的体外表达。这被认为是基因工程发展史上的一座里程碑。 1.1.1 t7nap机制 基于T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase,T7 RNAP)及其强启动子之间的特异性和转录的高效性建立的p ET系统(Novagen)是最常用的E.coli表达系统。T7 RNAP机制在诱导蛋白表达时,几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白,而且表达产物产量也特别高。 由λp L/c I(例如Invitrogen p LEX)、Trc(例如Amersham Biosciences p Trc)、Tac(例如Amersham Biosciences p GEX)、lac/T5(例如Qiagen p QE)等启动子构成的其他原核表达体系也常用于重组蛋白的原核表达。 1.1.2 促进宿主蛋白酶活性的变化 一般来说,在E.coli中表达的外源蛋白可以分为三类:可溶性蛋白、分泌蛋白以及包涵体蛋白。 (i)可溶性蛋白是目的蛋白与一段融合标签序列(FLAG、His-Tag、GFP等)融合表达而形成。这些融合标签将为进一步的蛋白浓缩、提纯、检测等提供便利,同时也可以有效的抑制宿主蛋白酶的降解活性。 (ii)采用信号肽序列可以将蛋白直接分泌到细菌的周质腔去。分泌表达可以显著降低胞内蛋白酶对蛋白的降解作用、简化蛋白纯化过程,同时有助于重组蛋白形成正确的空间结构。大肠杆菌中,已成功使用了各种不同类型的信号肽,将细胞质中表达的蛋白质转运到周质。 (iii)包涵体蛋白的形成是由于肽链折叠过程中,部分折叠中间态发生特异性错误聚合,不能形成成熟的天然或完全解链的蛋白所致。包涵体表达虽然可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解,但对表达产物的活性不利。因此,需要后续的溶解与复性等。 1.1.3 e.coli在基因翻译中的修饰作用 迄今为止,E.coli作为第一个用于重组蛋白生产的宿主菌,由于其遗传背景清楚、培养操作简单、转化效率高、生长繁殖快、成本低廉,且可以快速大规模地生产目的蛋白等优点而被广泛地用于外源蛋白的表达。 但是,作为原核表达宿主的E.coli不能产生诸如N-和O-端糖基化、脂肪酸酰化、磷酸化以及二硫键的形成等翻译后修饰。而这些修饰作用对活性蛋白的生物活性、功能、结构、溶解度、稳定性,以及半衰期等都是非常重要的。而且,E.coli表达的蛋白还会保留它们氨基末端的甲硫氨酸,这会影响到目的蛋白的稳定性,并产生免疫原性。 1.1.4 融合e.coli和tki的作用机制 近几年来,对大肠杆菌表达系统的研究,已经从最初的构建不同的表达载体建立新的表达系统转移为完善现有的表达系统,解决表达系统中的各种缺陷,包括:采用RosettaTM(Novagen)代替BL21菌株来增强含有E.coli稀有密码子的重组蛋白的表达水平;采用BL21(DE3)、BL21(DE3)p Lys S以及BL21(DE3)p Lys E(Invitrogen)弥补高浓度的胞内酶环境对具有生物活性的目的蛋白在E.coli中表达的抑制等。 最近几年来,研究人员逐步将研究重点放在通过将一些具有活性的小蛋白与目的蛋白融合,进而促进目的蛋白在E.coli中的表达,或者通过改造某种现有的表达载体,通过将各种促溶标签与载体融合,进而使得某些在E.coli中不表达的蛋白得以表达或使原本以包涵体形式表达的蛋白以可溶性形式表达。这些标签包括FLAG、MBP、GST、thioredoxin等。 1.2 枯草杆菌壁内毒素检测 枯草杆菌,学名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili),细胞壁不含内毒素,是一些重要工业酶制剂的生产菌。1958年,Spizizen等首次发现枯草杆菌168菌株能够摄取外源基因。此后,随着基因重组技术的发展,以枯草杆菌为宿主细胞的表达系统迅速发展起来。 1.2.1 枯草杆菌基因检测 作为外源基因表达的宿主,枯草杆菌有以下优势:(1)非致病的土壤微生物