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6种中药有效成分对smmc-7721肝癌细胞增殖的影响 肝癌是中国面临的最大发病率之一。世界上每年发生26万多例肝癌，其中42.5%发生在中国。我国肝癌死亡率在20年中增加了41.17%。因此,研究开发有效的抗癌及抗肝癌药物是研究者的重要任务。近年来,在中药中筛选有效且毒副作用小的抗肿瘤药物已成为中草药研究领域的热点之一。目前,人们从中药中找到并开发出许多有价值的抗肿瘤药物,如喜树碱、美登素、紫杉醇等,并对具有抗肿瘤活性的中药有效成分进行了较深入的研究。本实验采用MTT法检测了龙胆苦苷等6种中药提取物对SMMC-7721人肝癌细胞增殖的影响,为筛选具有开发价值的抗癌药物提供了依据。 1 材料和方法 1.1 肺癌细胞培养基 龙胆苦苷由西北大学孙文基教授提供,含量99%以上;土贝母皂苷含量为95%,白屈菜红碱和血根碱含量为50%,败酱草和威灵仙为水提物,均由西安鸿生生物技术有限公司提供。药品用三蒸水配成不同浓度,过滤除菌后分装备用。 SMMC-7721人肝癌细胞(由第四军医大学提供)培养于含有10%小牛血清(体积分数)和双抗(青霉素、链霉素,终浓度为200 U/mL)的RPMI1640(Hyclone)培养基中,在饱和水蒸汽的CO2孵箱中培养。 噻唑蓝(MTT)为Sigma公司产品,用磷酸缓冲液(PBS,0.1 mol·L-1,pH 7.2～7.4)配成浓度为1 g·L-1的溶液;RPMI1640培养基为Hyclone产品;胰蛋白酶(Trypsin)为Sigma公司产品,用D-Hanks溶液配成浓度为1.25%的溶液,过滤除菌-20℃避光保存,使用时用PBS(0.1 mol·L-1,pH 7.2)+0.02% EDTA溶液稀释为0.25%的工作液。 1.2 tecara-1332-raise酶标仪 CO2培养箱(BB16HF):上海力申科学仪器有限公司;TECAN A-2082 RUNRISE酶标仪:澳大利亚TECAN公司;高速冷冻离心机(5810R):德国Eppendorf公司。 1.3 细胞生长曲线 用MTT法测定8种初始细胞浓度(5×103～1×106cells/mL)分别在5个孵育时间(12,24,36,48,60 h)下的细胞活力,绘制细胞生长曲线,选择最适接种浓度和孵育时间。 1.4 实验处理 1.4.1 l-1的浓度 龙胆苦苷、土贝母皂苷、白屈菜红碱和血根碱5种药物,采用3个浓度:106,104,102nmol·L-1;败酱草水提物和威灵仙水提物的3个浓度分别为:1 g·L-1,10 mg·L-1,0.1 mg·L-1。 1.4.2 测定项目及方法 待细胞生长至对数期,用胰蛋白酶消化收集细胞,调密度至5×104cells/mL,以0.1 mL/well接种于96孔板中,每个处理设4个复孔,置CO2培养箱中孵育,12 h后加入药物,作用不同的时间后加入MTT(0.01 mL/well),再孵育4 h后,离心30 min(4 000 r·min-1),吸弃上清,每孔加0.2 mL DMSO,酶标仪检测吸光度值,采用t检验进行数据分析。 2 结果与分析 2.1 细胞活力的测定 由图1可见,当肝癌细胞接种浓度为1×104和5×103cells/mL时,细胞在60 h内始终处于潜伏期;接种浓度为105～106cells/mL时可见细胞活力在不同时间被抑制;而当接种浓度在5×104和2.5×104cells/mL时,随着孵育时间的延长细胞活力平稳上升,表明细胞生长状态良好,而密度为2.5×104cells/mL细胞的潜伏期比细胞密度在5×104cells/mL时的潜伏期长,所以选用5×104cells/mL作为药物处理时细胞的初始浓度。 2.2 血根碱作用对肺癌细胞生长的影响 由表可见,肝癌细胞经104和102nmol·L-1的龙胆苦苷作用48 h后,细胞活力降低,其MTT值与对照相比差异显著(P0.01)。而在浓度为10 mg·L-1的败酱草提取物的作用下,肝癌细胞的MTT值与对照相比有极显著的提高(P0.01),提示败酱草可促进细胞增殖。在浓度为1 g·L-1败酱草提取物作用下,随着作用时间的延长,细胞的MTT值逐渐降低,在48 h达到最低,与对照相比差异显著,表明1 g·L-1败酱草提取物对细胞具有生长抑制作用。实验结果还显示1g·L-1和10 mg·L-1的威灵仙提取物能促进肝癌细胞的生长,与对照相比能显著的提高肝癌细胞的MTT值(P0.01)。此外,0.1 mg·L-1的威灵仙提取物与细胞作用12 h和24 h后却抑制细胞生长,其MTT值与对照相比具有显著差异(P0.01)。 实验结果显示:肝癌细胞经102,104和106nmol·L-1的土贝母皂苷作用后,细胞活力明显降低,MTT值与对照组相比差异显著(P0.01)