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抗n单克隆抗体的筛选及cielisa试剂盒的建立 19-去甲基环酮（17hydr氧-19-norad-4-en-3，nt）具有很强的促蛋白质合成能力，可参与生长发育和骨骼发育的生理调节，促进骨骼和肌肉的生长。因此，在20世纪70年代之前，许多国家和地区使用19-去甲环酮作为动物饲料的促生剂，以提高生产工量，提高饲料成本。由于有很强的残留毒性,从1986年开始,欧盟就禁止在食源性动物生产中使用促蛋白同化激素来育肥家畜,以保护消费者避免因食用激素的残留物或代谢物而引起的发育问题、神经问题、遗传毒性和癌症问题。2002以后,中国政府也禁止在家畜育肥过程中使用性激素类原料药及其单方、复方制剂。 激素残留传统的检测方法有气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱-质谱法(LC-MS)等。但这些方法成本高,需要专业的技术人员,昂贵的实验仪器及长时间的前期准备工作,不适合大批量的市场监测要求。而免疫学检测方法建立在抗体对抗原的分子识别上,其主要优点是亲合力高、快速、简单、经济实用,能够实现对生物液体的小体积、大通量检测,逐渐成为世界各国有毒有害残留物快速检测的方法之一。目前,代表性的19-去甲睾酮免疫学检测方法有放射性免疫分析法(RIA),化学发光免疫检测法(CLISA),酶联免疫检测(ELISA),胶体金试纸条和免疫传感器等。但这些免疫学方法中,有的达不到食源性动物中激素残留参考检测限(2ng/ml),有的不适合国内推广应用。本文首次用异源性ciELSA检测方法筛选抗19-去甲睾酮单克隆杂交瘤细胞株,制备高亲和力单克隆抗体。研制的ciELISA试剂盒灵敏度高、特异性强,适合食源性动物生产中19-去甲睾酮激素残留的快速检测。 1 材料和方法 1.1 其它试剂和培养基 19-去甲睾酮、群勃龙、甲羟孕酮、甲睾酮、氯睾酮,德国Dr公司; 雌二醇、己烯雌酚、玉米赤霉醇、盐酸克伦特罗、牛血清白蛋白(BSA,MW67 000)、鸡卵清蛋白(OVA,MW45 000), Sigma公司;小鼠骨髓瘤NS0细胞株, 英国国家动物健康研究院惠赠;鼠单克隆抗体鉴定试剂盒、碳化二亚胺(EDC)、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA), Pierce产品;N-羟基琥珀酰亚胺(NHS), 日本株式会社产品;羊抗鼠酶标二抗(GaMIgG-HRP), 华美生物工程公司;透析袋(8 000～14 000Da), Solarbio产品;96孔聚乙烯酶标板、96孔和24孔细胞培养板、100ml细胞瓶, Costar公司;RPMI-1640、HAT、HT培养基, Gibco公司;PEG-1500(50%), Roche产品;胎牛血清(FBS), 杭州四季清生物工程公司;琥珀酸酐、四甲基联苯胺(TMB)、非那西丁、过氧化脲, Sigma产品;其它所有试剂均为分析纯。 碳酸盐缓冲液(CBS,pH 9.6)含有Na2CO3(15mmol/L)和NaHCO3(35mmol/L);磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)含有NaCl(137mmol/L),Na2HPO4.12H2O(10mmol/L),KCl (2.68mmol/L) 和 KH2PO4(1.47mmol/L);洗液(PBST)为含有0.05% 吐温-20的PBS;封闭液、稀释液为含有5%猪阴性血清的PBST;酶底物为TMB的磷酸-柠檬酸缓冲液(A、B);终止液为2mol/L H2SO4。 6～8 周龄Balb/C小鼠购自北京医科大学动物实验中心,本实验室动物房繁育。 1.2 实验仪器和仪器 MULTISKAN MK3酶标仪, 美国Thermo公司;GS15R高速冷冻离心机, 美国Thermo公司;Galaxy S+型CO2细胞培养箱, 英国RS-Biotech公司;TS100-F倒置生物显微镜, 日本Nikon公司;925REL#10超低温冰箱, Thermo Forma公司;eLINE微量移液器, 芬兰百得公司;SZ-97自动三重蒸馏水器, 上海雅荣生化仪器有限公司;PHS-3TC精密酸度计, 上海天达仪器有限公司。 1.3 免疫原的合成 参照文献,用琥珀酸酐改造19-去甲睾酮上C-17羟基,然后用EDC两步法合成免疫原(NT-17-BSA)(图1)。参照文献,用羧甲基羟胺半盐酸将3号位羰基衍生化,再用混合酸酐法合成包被原(NT-3-OVA)(图2)。 1.4 免疫原诱导乳化 用NT-17-BSA免疫6～8周龄雌性Balb/C小鼠10只,剂量为60μg/只,体积为0.2ml,颈背皮下多点注射。首免用PBS稀释的免疫原与等体积FCA完全乳化,以后每隔3w加强免疫一次,换用FIA乳化,共免疫5次。最后1次免疫后8天断尾采血分离血清,用间接ELISA和间接竞争ELISA筛选效价高,抑制效果好的小鼠作为融合备用鼠。 1.5