DB1304T 440-2023犊牛腹泻病原荧光定量检测技术规程.docx

ICS DB1304 DB1304 邯 郸 市 地 方 标 准 DB 1304/ T440—2023 犊牛腹泻病原荧光定量检测技术规程 2023 - 08 - 21 发布 2023 - 08 - 30 实施 邯郸 市 市场监督管理局 发 布 I DB1304/ T440—2023 前 言 本文件按照 GB/T 1.1－2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》规则起 草。 本文件由河北工程大学提出。 本文件起草单位：河北工程大学、邯郸市标准化所。 本文件主要起草人：王方方、钟翠红、刘冠慧、石博文、张永英、王书秀、杨利、李萌、吴丽丽、 刘辉、何晓玲、袁英、崔濮凡。 1 DB1304/ T440—2023 犊牛腹泻病原荧光定量检测技术规程 1 范围 本文件规定了双重荧光定量 PCR 检测犊牛腹泻病原大肠杆菌和微小隐孢子虫的技术要求。 本文件适用于犊牛腹泻病原大肠杆菌和微小隐孢子虫的快速检测和流行病学调查，肉牛和奶牛腹泻 也可参照执行。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 WS271—2007（感染性腹泻诊断标准） 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 3.1 PCR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction) 3.2 RT-qPCR：荧光定量 PCR(Real-time quantitative PCR) 3.3 PBS：磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline) 3.4 Ct 值：循环阈值(Cycle Threshold) 3.5 DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid) 3.6 Tm 值：解链温度(Melting Temperature) 4 4 样品采集、保存、运输和处理 4.1 样品采集 用棉拭子从犊牛直肠采集粪便，或用一次性手套采集新鲜粪便约 20 g，装入一次性封口袋。每份 样品标记编号、名称、动物来源、动物年龄、采样时间、采集单位或畜主姓名及地址。 4.2 样品保存和运输 采集的样品在 2℃-8℃条件下保存应不超过 72 h，长期保存需加入等体积 5%重铬酸钾溶液，装入 灭菌容器内 4℃保存。样品运输应放在一个不透水、防泄漏的容器内，将上述容器置于结实、不透水和 2 DB1304/ T440—2023 防泄漏的辅助包装中。冷冻剂放在辅助包装周围，确保样品在 48 h 内送达实验室。 4.3 样品的预处理 4.3.1 将经高压灭菌或 80℃-100℃烘烤 20 min 的 60 目-100 目铜筛网置于无菌漏斗中，放置在固定好 的铁架台上，漏斗下端置于 50 mL 离心管中。取 10 g 待检样品（若是成形的粪便应混匀；若粪便含水 量高，混匀后取 10 mL）放入烧杯中，加 30 mL PBS，玻璃棒或压舌板混匀后经 60 目-100 目铜筛网过 滤至离心管中。 4.3.2 滤液用移液器吸取 1.5 mL 放入 2 mL 离心管中，-20℃保存，用于 DNA 提取。 4.3.3 剩余滤液 1500 r/min 离心 10 min，弃上清。沉淀加入等体积 5%重铬酸钾溶液，装入灭菌容器内 4 ℃保存备用。 5 操作程序 5.1 DNA 抽提 将保存于 2 mL 离心管中的样品以 1500 r/min 离心 5 min 后，弃上清，沉淀用于 DNA 的提取，按从 粪便中提取 DNA 的商品化试剂盒说明书进行操作。 5.2 荧光定量 PCR 检测 5.2.1 荧光定量 PCR 反应体系的配制。 在反应混合物配制区进行。从试剂保存盒中取出大肠杆菌和微小隐孢子虫的上下游引物及其探针、 2×FastFire qPCR PreMix，灭菌超纯水，在室温下融化后，3000 r/min 离心 5 s。设定 PCR 数为 n+2， 其中 n 为待检样品数，加上一管阳性对照及一管阴性对照，每个样本测试反应体系配制（见附录 B）。 计算好各试剂的使用量，加入一个适当体积的离心管中，向其中加入 12.5 μL×（n+3）的 2×FastFire qPCR PreMix,大肠杆菌和微小隐孢子虫上游引物各 0.75 μL×（n+3），大肠杆菌和微小隐孢子虫下游 引物各 0.75 μL×（n+3），探针各 0.5 μL×（n+3），5.5 μL×（n+3）的灭菌去离