基于荧光原位杂交技术的分子生物技术在污水生物处理系统中硝化菌群研究中的应用.docxVIP

基于荧光原位杂交技术的分子生物技术在污水生物处理系统中硝化菌群研究中的应用 在废水生物处理系统中的微生物研究是废水生物处理最基本、最重要的内容，也是废水生物处理系统高效、稳定运行的保障。传统的微生物研究方法依赖纯培养技术来分离细菌。该方法对研究废水生物处理系统中的微生物系统存在严重缺陷。首先，废水生物处理系统中的微生物群由各种微生物组成，具有一定的空间分布。这些微生物相互依存、竞争，并有复杂的序列关系。通过分离和培养细菌，我们无法获得在自然条件下获得微生物群结构和空间分布信息的微生物。其次，由于微生物遗传和代谢活动的巨大影响，细菌的分离和栽培改变了微生物的生理特征和生化特征，这降低了实际工程实践的重要性。此外，纯培养需要很长的时间，有些菌株（如亚硝酸盐氧化菌的nitoshun）不能通过纯培养技术进行纯分离。 近年来,分子生物技术的快速发展为污水生物处理系统内微生物研究提供了新的分析方法和手段.污水生物脱氮包括硝化和反硝化两大阶段.其中硝化菌群是硝化阶段的功能微生物,包括将NH4+-N氧化为NO2--N的氨氧化菌(Ammonia oxidizing bacteria,AOB)和将NO2--N氧化为NO3--N的亚硝酸盐氧化菌(Nitrite oxidizing bacteria,NOB).AOB和NOB在污水生物处理系统内的生物活性和菌群分布的稳定性,是保证污水生物脱氮系统稳定运行的关键因素之一.因此,采用分子生物技术对不同工艺、水质条件下的AOB和NOB的菌群结构、活性等进行研究分析,能够为污水生物脱氮系统的长期稳定运行提供有力保障.目前,以FISH和PCR为代表的分子生物技术已广泛应用于污水生物处理系统内硝化菌群结构和生物活性的研究中,国外已有大量的相关文献报道,但在国内还处于起步研究阶段. 1 在环境生物原位分析中的应用 FISH技术是根据目标微生物16S r RNA基因中的特异性序列,设计相应的、带有荧光染料的寡核苷酸探针,按照碱基序列互补原则,将探针直接原位杂交到目的基因上,杂交成功的探针就会产生荧光信号.然后通过共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)或者荧光显微镜对目的基因进行定性和相对定量分析.典型的FISH图片如图1所示.通过选取系统发育中保守性不同的特异性序列,就可在种、属水平上对微生物进行检测.因此,FISH技术还可用于研究微生物种群的结构动态变化.自从Amann等最初将FISH应用于环境微生物的原位分析以来,该方法已被用于污水生物处理系统内丝状菌、聚磷菌、硝化菌[4~5]、厌氧氨氧化菌等的原位检测.近几年,研究者在普通FISH的基础上发展了几种更为先进的分子生物学分析方法,用于对污水生物处理系统内硝化菌群的研究:FISH-MAR(Microautoradiography,显微放射自显影)技术、FISH-microelectrodes(Microelectrodes,微电极)技术和Clone-FISH技术. 1.1 fish-ro显微检测 单独采用FISH技术,并不能获取微生物种群的生物代谢活性和生理功能的信息.而单独采用MAR技术,却无法对微生物种群的组成及其分布加以识别.Lee等首先将这两种技术结合,建立了FISH-MAR方法.该方法能够以显微照片的形式,清晰、直观地显示出复杂的微生物群体的菌群结构及其原位空间分布情况,而且同时能够反映出不同微生物种群的生物代谢活性.该方法的基本流程可总结如图2,其核心思想是将待分析的微生物样本放置在经放射性物质标记的有机或无机底物中进行培养,其中能够吸收放射性底物的细胞将在放射自显影的显微图片上呈现黑色的影像(MAR阳性,MAR+),而没有吸收放射性底物的细胞则没有影像显示.对于异养型微生物通常采用14C标记的有机底物,如14C-乙酸;对于无机自养型硝化细菌,通常采用Na H14CO3.图3为一典型的Fish-MAR显微图片,图中的黑色细胞为吸收了Na H14CO3的化能自养型细菌,红色细胞为通过FISH探针检测到的AOB,二者的细胞数比例表示化能自养型细菌中AOB所占的比例;绿色细胞是FISH探针检测到的NOB. Okabe课题组采用FISH-MAR方法对自养型硝化生物膜中的微生物代谢进行了研究.研究者首先将自养型硝化生物膜在含有Na H14CO3的底物中培养6 h,其中自养硝化菌呈MAR+,异养菌呈MAR-.再将含MAR+硝化菌和MAR-异养菌的生物膜在仅含有NH4+的溶液中培养10 d,结果发现多数异养菌呈现MAR+,说明异养菌能够利用14C标记的硝化菌细胞裂解产物或代谢产物,从而揭示了在碳源受限的自养型硝化生物膜中微生物在底物利用上的相互作用关系[8~9].该研究指出在碳源受限的硝化生物膜中硝化菌