常用分子生物学技术的原理及应用.ppt

第六十一页，共一百二十三页，2022年，8月28日 The Nobel Prize in Chemistry 1980 "for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA" "for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids" Paul Berg Walter Gilbert Frederick Sanger 1/2 of the prize 1/4 of the prize 1/4 of the prize Stanford University Stanford, CA, USA Harvard University, Biological Laboratories Cambridge, MA, USA MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom 第六十二页，共一百二十三页，2022年，8月28日 三、DNA自动测序 用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。 用不同荧光分子标记4种ddNTP，然后进行Sanger测序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离。 通过4种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出4种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 第六十三页，共一百二十三页，2022年，8月28日 目前所用自动测序技术同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳 多色荧光标记 毛细管电泳 单色荧光标记 平板电泳 同位素标记 平板电泳 A C G T A C G T 测序图谱 T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T 第六十四页，共一百二十三页，2022年，8月28日 DNA测序仪示意图 computer analysis 凝胶中DNA移动方向 样品槽 激光器 输入光学系统 成象透镜 聚焦透镜 高灵敏度相机 旋光镜/棱镜组件 第六十五页，共一百二十三页，2022年，8月28日 DNA自动测序结果举例 第六十六页，共一百二十三页，2022年，8月28日 ABI PRISM 310型 DNA测序仪 第六十七页，共一百二十三页，2022年，8月28日 目前所用测序技术的缺点 1、测序的原理是DNA链终止法，这注定了一个反应所测序列不可能太长，目前为1000个核苷酸左右。 2、测序反应费时费力 科学家们完成第一个人类基因组测序整整花了13年的时间，耗费了30亿美元的费用。 3、测序准确度不高 DNA聚合酶造成的碱基错配，DNA序列判读错误。 4、测序基于PCR反应，需要引物，并且有些结构复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。 第六十八页，共一百二十三页，2022年，8月28日 下一代测序技术 下一代测序技术又称为二代测序技术，其代表技术为罗氏公司(Roche)的454测序仪(Roche GS FLX sequencer), Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。 第六十九页，共一百二十三页，2022年，8月28日 第七十页，共一百二十三页，2022年，8月28日 特点 测序策略主要基于循环芯片测序法（Cyclic-array sequencing），即制备DNA文库，单分子扩增，在固相载体上形成DNA簇阵列，并行地利用DNA聚合酶或者连接酶进行酶促反应（模板变性、引物退火杂交、延伸或连接），同时读取反应产生的特异性荧光信号，最终得到超大量的DNA序列信息。 高通量并行测序。例如，Roche GS FLX sequencer一次就可对上百万条DNA分子同时进行序列测定，一次运行通量达到400Mb以上，而传统测序（一代测序）一轮测序的通量仅为80Kb左右。 单分子测序。传统测序（一代测序）是对多个DNA分子的混合物进行测序，其测序结果是多个DNA分子综合的序列信息；而二代测序先对单个DNA分子进行PCR以放大DNA分子数量（相当于单个DNA分子的克隆复制），再对这些DNA分子进行测序，就可以得到原来单个DNA分子的序列信息。 第七十一页，共一百二十三页，2022年，8月28日 新型纳米孔测序法 新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现