第三章序列分析详解.ppt

基本过程：分别抽提代测样本(tester）和 对照样本（driver)的mRNA，反转录成cDNA，用RsaI或HaeIII酶切，以产生大小适当的平头末端cDNA片段，将tester cDNA分成均等的两份，各自接上两种接头，与过量的driver cDNA变性后退火杂交，第一次杂交后有4种产物：a是单链tester cDNA，b是自身退火的tester cDNA双链，c是tester 和diver的异源双链，d是driver cDNA。第一次杂交的目的是实现tester单链 cDNA均一化(normalization),即使原来有丰度差别的单链cDNA的相对含量达到基本一致，由于tester cDNA中与driver cDNA序列相似的片段大都 和driver形成异源双链分子c，使tester cDNA中的差异表达基因的目标cDNA得到大量富集，第一次杂交后，合并两份杂交产物，再加上新的变性driver单链，再次退火杂交，此时，只有第一次杂交后经均等化和扣除的单链tester cDNA和driver cDNA一起形成各种双链分子，这次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA，产生了一种新的双链分子e，它的两个5’端有两个不同的接头，正由于这两上不同的接头，使其在以后的PCR中被有效地扩增。 当前第126页\共有187页\编于星期三\8点 抑制性差减杂交技术（SSH）原理图（Diatchenko等，1996） 当前第127页\共有187页\编于星期三\8点 二、序列测定及数据分析 随机挑取克隆进行5’或3’端测序 序列前处理 聚类和拼接 基因注释及功能分类 后续分析 当前第128页\共有187页\编于星期三\8点 测序方向的选择 根据不同的实验目的选择不同的测序方向： ◆5’端 5’上游非翻译区较短且含有较多的调控信息。一般在寻找新基因或研究基因差异表达时用5’端EST较好，大部分EST计划都是选用5’端进行测序的，而且从5’端测序有利于将EST拼接成较长的基因序列。 当前第129页\共有187页\编于星期三\8点 ◆ 3’端 3’端mRNA有一20－200bp的plyA结构，同时靠近plyA又有特异性的非编码区，所以从3’端测得EST含有编码的信息较少．但研究也表明，10％的mRNA3’端有重复序列，这可以作为SSR标记；非编码区有品种的特异性，可以作为STS标记． ◆ 两端测序 获得更全面的信息。 当前第130页\共有187页\编于星期三\8点 1. 去除低质量的序列（Phred） 2. 应用BLAST、RepeatMasker或Crossmatch遮蔽数据组中不属于表达的基因的赝象序列(artifactual sequences)。 ●载体序列(/repository/vector) ●重复序列(RepBase，) ● 污染序列 (如核糖体RNA、细菌或其它物种的基因组DNA等) 3. 去除其中的镶嵌克隆。 4. 最后去除长度小于100bp的序列。 序列前处理 (pre-processing) 当前第131页\共有187页\编于星期三\8点 CpG岛(CpG island) ? CpG岛是指DNA上一个区域，此区域含有大量相联的胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G），以及使两者相连的磷酸酯键（p）。哺乳类基因中的启动子上，含有约40%的CpG岛（人类约70%）。一般CpG岛的长度约300到3000个bp。 通常的含义是指一个至少含有200bp的区域，其中GC所占比例超过50%，且CpG的观察值/预测值比例必须高于0.6。此霸部份的CpG岛与基因相连，可用来作为限制酶的辨识位置。???? 当前第94页\共有187页\编于星期三\8点 哺乳动物基因组DNA中CpG岛的特点是胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的总和超过4种碱基总和的50%，即每10个核苷酸约出现一次双核苷酸序列CG。具有这种特点的序列仅占基因组DNA总量的10%左右。从已知的DNA序列统计发现，几乎所有的管家基因(House-Keeping gene)及约占40%的组织特异性基因的5’末端含有CpG岛，其序列可能包括基因转录的启动子及第一个外显子。 因此，在大规模DNA测序计划中，每发现一个CpG岛，则预示可能在此存在基因。另外，AT含量也可以作为编码区的批示指标之一。 当前第95页\共有187页\编于星期三\8点 ?CpG岛在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域，约有60％以上基因的启动子含有CpG岛。?CpG甲基化的研究在肿瘤的研究中有着非常主要的地位。通过基因启动子区及附近区域CpG岛胞嘧啶的甲基化可以在转录水平调节基因的表达，从而引起相应基因沉默，去甲基化又可恢复