不同北方浓香型白酒大曲中微生物组成及理化差异分析.docx

? ? 不同北方浓香型白酒大曲中微生物组成及理化差异分析 ? ? 任宇婷，乔美灵，乌力吉德布兴，杨玉珍，任国军，孙子羽，陈忠军，满都拉* （1.内蒙古农业大学 食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古河套酒业集团股份有限公司，内蒙古 巴彦淖尔 015400） 大曲作为一种含微生物和酶的糖化发酵剂，对白酒的产量和风格具有重要影响[1]。依据制作时所达到的温度的不同，可将大曲分为高温大曲（60～65 ℃）、中高温大曲（55～60 ℃）、中温大曲（50～55 ℃）和低温大曲（40～50 ℃），其中，中高温大曲主要用于浓香型白酒的生产[2]。 大曲中的微生物是在开放式生产过程中自然富集的，含有包括细菌、霉菌和酵母菌等在内的多种微生物[3]。高通量测序技术的应用，为研究大曲微生物物种组成、群落结构及演替规律提供了有力的工具[4-5]。有研究表明，不同类型大曲微生物组成不同[6]，同一类型不同地区大曲微生物多样性也存在差异[7]。在实际生产中往往要依据季节、原料、发酵特性等将不同大曲混合使用，以保证白酒的质量。如在清香型白酒中通常以红心曲、后火曲和清茬曲的混合曲用于生产[8]。红心曲可以提高芳香化合物的含量，后火曲可以调节苦味和酸味，清茬曲可以抑制含硫有机化合物的产生[9]。在酱香型白酒生产中，高温功能大曲与普通酱香型大曲以6∶4比例混合后可有效提高大曲质量，生产出典型的酱香风格白酒[10]。 实践中，多数情况下都是基于经验对不同大曲进行混合使用，缺乏进一步的理论支持。基于此，本研究以内蒙古河套酒业集团股份有限公司生产的3种中高温大曲为研究对象，通过理化检测和高通量测序技术分析其理化、微生物组成及多样性差异，并采用PICRUSt软件对微生物的功能进行预测，以期为生产中不同大曲的混合使用提供理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 材料 本研究所用大曲采自内蒙古河套酒业集团股份有限公司，分别采集实际生产中的3种不同大曲各3块，编号分别为Q1、Q2、Q3，每块用五点法取样后混合为一个样品。3种大曲均以小麦为原料制作而成，Q1、Q2和Q3大曲所用小麦分别产于河套、四川和山东地区，培曲顶火温度分别为60～63 ℃、58～60 ℃和58～62 ℃。 1.1.2 试剂 氢氧化钠、酚酞、磷酸氢二钠、柠檬酸、可溶性淀粉、三氯乙酸、硫酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；碘、碘化钾、氯化钴、重铬酸钾、铬黑T、无水葡萄糖、硫酸铜、亚甲基蓝、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、乳酸、乳酸钠、硼砂（均为分析纯）：天津永晟精细化工有限公司；福林试剂、酪氨酸（均为分析纯）：北京酷来搏科技有限公司；Omega EZNATM土壤基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：美国Omega Bio-tek公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒：美国AXYGEN公司。 1.2 仪器与设备 FA2104N电子天平：上海箐海有限公司；XMTD-8222恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；T6紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DHG-9053A电热鼓风干燥箱、GHP-9080恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；MiSeq PE250测序仪：美国Illumina公司；9700型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国ABI公司。 1.3 方法 1.3.1 大曲理化指标的测定 参照《酿酒分析与检测》（第二版）[11]测定大曲的水分、酸度、淀粉酶活力（液化型）、糖化酶活力、蛋白酶活力和发酵力。 1.3.2 大曲样品微生物菌群多样性分析 称取样品7.0 g，经0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）洗涤，收集菌体，采用Omega EZNATM土壤基因组DNA提取试剂盒提取大曲微生物基因组[12]。以其为模板，使用引物338F/806R和ITS1F/ITS2R分别对细菌16S rRNA V3-V4区和真菌ITS1-ITS2区基因序列进行PCR扩增[13]。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR扩增产物，将纯化后的PCR扩增产物委托上海凌恩生物科技有限公司进行高通量测序。 测序所得数据经FLASH（1.2.11）拼接后，使用Usearch（10）以97%相似度进行操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）划分，与Silva（138.1）和Unite（8.2）数据库进行比对注释。 1.3.3 数据处理 使用上海凌恩生物科技有限公司云平台（http：///CloudPlatform/）和R语言（Vegan包