三种原料对种曲微生物种类及变化影响研究.docx

? ? 三种原料对种曲微生物种类及变化影响研究 ? ? 李 锐，章 刚，张 磊，杨 强，刘源才，陈申习 （劲牌有限公司 劲牌研究院 中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北 大冶 435100） 绿衣观音土曲又名土曲、南曲，是湖南、湖北两地普遍用来酿制小曲酒的酒曲[1]。制作原料主要包括大米、油糠、观音土和种曲。而种曲是以大米、观音土和曲母为原料制成，将原料加水拌匀之后制成曲坯料，团好的曲坯料整齐排放在垫有糠壳的木制箱窝内，然后加盖竹席，此步骤称为入箱。入箱培养约24 h，即可出箱。将出箱的曲坯捡到垫有糠壳的竹盘上，竹盘架在竹盘架上，此时进入后熟阶段，整个后熟阶段培养4 d，分别称为“一烧”、“二烧”、“三烧”和“四烧”。四烧结束后，种曲即制作完成，从曲房拿出，贮存在通风干燥的曲库内。成品种曲呈圆饼状，表面微黄且分布着许多褶皱[2]。 种曲作为制作土曲的种子，其生产工艺及其含有的微生物数量及种类对土曲的质量有着最直接的影响。目前已发表的报道大多是关于大曲[3-4]或发酵酒醅[5]中的微生物，仅有少许文献对土曲中的微生物及相关研究进行了报道[6-7]，而对种曲生产中的微生物种类及数量变化研究极少。目前种曲的生产采用较多的仍为早籼米，但存在质量不稳定，受气候影响较大等问题。杂交粮和糯米作为常用的酿酒原料，它们所含有的营养物质相似，但各类成分含量又有所不同。作为微生物生长的培养基，酿酒原料对酒体风格有着直接的影响，而制曲原料同样也会影响酒曲质量[8]。本研究采用稀释培养法对三种原料（早籼米、杂交粮和糯米）制备的种曲样品中微生物进行平板计数，并结合分子生物学方法对分离纯化的菌株进行形态学观察及分子生物学鉴定，对种曲制作过程中微生物变化情况进行了初步探究，为进一步优化种曲工艺并提升土曲质量提供了理论指导。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 样品材料 以早籼米、杂交粮和糯米为原料制备种曲：取自劲牌有限公司毛铺制曲车间，每批种曲分别取入箱、出箱、一烧末、二烧末、三烧末和四烧末的样品进行试验。 1.1.2 化学试剂 土壤基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）提取试剂盒：天根生化科技有限公司；Primer Star Mix聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂：北京擎科生物科技公司；通用引物合成及测序由华大基因股份有限公司完成。其他试剂均为国产分析纯。 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：去皮马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L，pH自然。121 ℃灭菌20 min。 孟加拉红培养基：蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，孟加拉红0.033 g/L，琼脂20 g/L，氯霉素0.1 g/L，pH自然。121 ℃灭菌20 min。 LB培养基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L、琼脂20 g/L，pH自然。121 ℃灭菌20 min。 MRS培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏10 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖5 g/L，乙酸钠5 g/L，柠檬酸二胺2 g/L，吐温80 1 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，七水硫酸锰0.05 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，琼脂20 g/L，pH 6.8。121 ℃灭菌20 min。 1.2 仪器与设备 5804R型离心机：德国Eppendorf公司；T100型PCR仪：美国Bio-Rad公司；ZQPW-70型恒温摇床、SMI 12-2型恒温培养箱：天津Labotery公司；1-14型高速离心机：美国Sigma公司；DW-86L 626型超低温保温箱：青岛海尔特种电器有限公司；YX-280D型手提式高压蒸汽灭菌器：合肥华泰医疗设备有限公司。 1.3 实验方法 1.3.1 含水量测定 采用常压105 ℃烘箱干燥法[9]测定种曲样品含水量。 1.3.2 平板计数 利用密封式粉碎机将酒曲样品粉碎后过20目筛，称取10 g至干净的锥形瓶中，加入90 mL无菌水，混合均匀后置于30℃条件下振荡培养30 min，然后取1 mL上清液至9 mL试管中，每次稀释10倍至适当的梯度。取适量菌液，酵母菌计数采用PDA培养基涂布，霉菌计数采用孟加拉红培养基涂布，细菌计数采用LB培养基涂布，乳酸菌计数采用MRS培养基倾注法。真菌培养基放置在30 ℃培养箱、细菌培养基放置在37 ℃培养箱进行培养，每隔一段时间观察菌落生长情况，72 h后计算菌落数量，并结合含水量数据换算成干样品中的含菌数（CFU/g）[10]。 1.3.3 菌种分离及鉴定 菌株分离：挑取每种培养基上不同形态特征的菌落进行划线，得到单菌落后制作