细胞内因子的流式检测.ppt

第一页，共十页，2022年，8月28日 基本概念 细胞内细胞因子染色是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。 Th1细胞分泌IFN-g、IL-2、TNF-a Th2细胞分泌IL-4;IL-5;IL-10 第二页，共十页，2022年，8月28日 技术优势 快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便 简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMC 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统 高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析 安全：减少样本处理与生物源性污染 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况 第三页，共十页，2022年，8月28日 所需试剂 1、细胞表面染色用的荧光标记的单抗试剂 如CD3、CD4、CD8、CD25等 2、荧光标记的细胞因子抗体： 如IFN-g、TNF-a、IL-2、IL-4等 3、溶血素：裂解红细胞 4、激活剂： 如PMA、Ionomycin，可以刺激T细胞活化并分泌细胞因子 第四页，共十页，2022年，8月28日 所需试剂 5、阻断剂 阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内质网内，以利于准确检测细胞产生细胞因子的能力。 Monensin Brefeldin-A(BFA) 6、固定剂 固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。 一般使用含4%的多聚甲醛PBS溶液 7、破膜剂 将细胞膜穿孔，以利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与相应的细胞因子结合。 一般使用含1％皂甙、0.05％NaN2的Hanks溶液/HBBS 第五页，共十页，2022年，8月28日 操作步骤 细胞表面抗原染色 刺激细胞（PMA、Ionomycin、BFA） 固定、破膜 细胞因子染色 第六页，共十页，2022年，8月28日 注意事项 标本处理：避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。 刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测IFN-γ则可选择PMA和Ionomycin同时刺激；如果用CD4做表面标记，由于多数病人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析。 第七页，共十页，2022年，8月28日