无患子总皂苷提取工艺优化及其对酪氨酸酶的抑制活性 -《江苏农业科学》(2020年9期).docx

龙源版权所有 无患子总皂苷提取工艺优化及其对酪氨酸酶的抑制活性 作者：刘俊宏 邱智东来源：《江苏农业科学》2020年第09期 关键词：无患子;总皂苷;提取工艺;富集工艺;正交试验;酪氨酸酶;黑色素 无患子产于长江流域以南[1]，《本草纲目》《鸡肋篇》均有记载，称为肥珠子、油珠子[2]。无患子果皮皂苷成分主要为三萜及倍半萜类，具有较强的表面活性作用[3-4]，含量达5.33%[5]。《本草纲目》中载：洗头去风明目，洗面增白祛斑。在现代中药及天然药物化学研究中认为，无患子中活性物质可以通过对酪氨酸酶、氧化酶、多巴色素互变酶的作用，抑制黑色素的产生，从而达到美白效果。在这其中，酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶，对酪氨酸酶活性的控制，是美白护理的关键。近年来虽有报道无患子提取物对酪氨酸酶有抑制作用[6-7]，但对无患子总皂苷提取工艺优化及对酪氨酸酶活性抑制作用鲜有新的报道，本研究拟通过优化无患子总皂苷提取工艺、考察无患子皂苷对酪氨酸酶活性的抑制作用，来评价无患子总皂苷美白护肤的作用效果，为无患子在美白护肤化妆品的工业化生产提供可行性方案。 1 材料与方法 1.1 试验仪器与材料 试验仪器：药物天平（JYT-2，上海医用激光仪器厂）;电子天平[AL-204，梅特勒-托利多（上海）有限公司];超声提取器（SY-360，上海宁商超声仪器有限公司）;电热恒温水浴锅（WMZK-72，上海跃进医疗器械厂）;电热鼓风干燥箱（DHG-9035A，上海源长实验仪器设备厂）;恒温水浴锅（HH-S6，天津先权有限公司）;酶标仪（SpectraMax PLus-384，美谷分子仪（上海）有限公司）旋转薄膜蒸发仪（R-3001，郑州长城科工贸有限公司）。 试验材料：无患子（2018年12月购于海宁市盐官苗木合作社，产于浙江）由长春中医药大学董金香教授鉴定;酪氨酸酶（25 000 mg，Sigma公司）;DOPA（Sigma公司）;磷酸缓冲盐（北京化工有限公司）;熊果苷标准品（批号：110742-201620，中国药品生物制品检定所）。大孔吸附树脂D101（上海恒远生物技术发展有限公司）。 1.2 试验方法 1.2.1 无患子总皂苷提取工艺优化 1.2.1.1 标准曲线建立 精确称取齐墩果酸标准品12.5 mg，甲醇定容至50 mL，配制成为 0.25 mg/mL 齐墩果酸标准品溶液，待用。分别精确量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL配制好的齐墩果酸标准品溶液置于比色皿中，70 ℃下水浴蒸干溶液，将蒸干后各比色皿中分别加入3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液、4.5 mL 60% H2SO4溶液，充分振荡，摇匀。将得到溶液于60 ℃恒温水浴中加热15 min，冷却后静置15 min，待测。以空白溶液为参比，于520 nm波长处测定各组样品的吸光度[8-9]。以测得结果的吸光度为纵坐标和对应的质量浓度为横坐标绘制标准曲线。 1.2.1.2 单因素考察 1.2.1.2.1 乙醇浓度考察 称取无患子果皮30 g，料液比为1 g ∶ 10 mL提取时间，为30 min条件下，将乙醇浓度设定为10%、30%、50%、70%、90%，分别进行提取1次，旋蒸回收溶剂浓缩并制成干膏，将所得干膏进行总皂苷含量比较。 1.2.1.2.2 提取时间考察 称取无患子果皮30 g，以10%乙醇为提取溶剂，在35 ℃料液比为 1 g ∶ 10 mL 条件下，将提取时间设定为30、60、90、120、150 min，分別提取1次，旋蒸回收溶剂浓缩并制成干膏，将所得干膏进行总皂苷含量比较。 1.2.1.2.3 料液比考察 称取无患子果皮30 g，以10%乙醇为提取溶剂，在35 ℃提取30 min条件下，将料液比（g ∶ mL）设定为1 ∶ 10、1 ∶ 30、1 ∶ 50、1 ∶ 70、1 ∶ 90，分别提取1次，旋蒸回收溶剂浓缩并制成干膏，将所得干膏进行总皂苷含量比较[10-12]。 1.2.2 正交试验设计 试验选择超声提取法进行无患子总皂苷的提取。按L9（34）正交表进行试验，选择提取溶剂浓度、提取时间、料液比为考察因素（表1），选择无患子总皂苷含量为考察指标设计试验。 1.2.3 验证性试验 按照“1.2.2”节下所得最优提取方案连续提取3次，通过3次总皂苷得率结果，考察最优方案的稳定性。 1.2.4 酪氨酸酶抑制率测定方法 1.2.4.1 样品制备 称量1 000 g无患子果皮粉末，使用所得的最佳工艺提取无患子总皂苷，浓缩提取液，蒸干提取液成干膏，备用。 1.2.4.2 大孔树脂吸附富集 取3份最优方案提取总提取物，每份取10 g，分别定容至50 mL容量瓶中。准确量取已经预处理的D101大孔树脂200 mL 3份，湿法装柱