百日菊白粉菌的分子检测与鉴定-《江苏农业科学》(2020年6期).docx

龙源版权所有 百日菊白粉菌的分子检测与鉴定作者：刘闰 周暄 邢帅来源：《江苏农业科学》2020年第06期 摘要：对百日上的白粉菌进行分子生物学分析，采用试剂盒法提取病原菌总基因组DNA，PCR扩增其rDNA内转录间隔区（internal transcribed spacer，简称ITS）的保守序列并测序，并通过Clustal与MEAG软件构建系统发育树推演系统进化关系，在分子水平鉴定该菌种并比较与其他白粉菌菌种的亲缘关系。结果表明，本研究测序的百日菊白粉菌BC180623的ITS序列与发生在土耳其菊芋上的Erysiphe cichoracearum（KF453969.1）相似度达到99%，与其具有比较近的亲缘关系。以百日菊白粉菌为研究对象，在分子水平鉴定该菌种并分析其进化亲缘关系为本试验的创新之处。 关键词：百日菊;白粉菌;内转录间隔区;序列分析 中图分类号：S435.672 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2020）06-0098-06 百日菊（Zinnia elegans Jacq.）别称百日草，为中药材，以全草入药。百日菊也是一年生草花主栽品种之一，其色彩丰富，花大、艳丽，花期长达百日，故得百日菊之美名。白粉病是百日菊常见的最重要病害之一，在生长区几乎每年都普遍发生[1-3]。百日菊被白粉菌侵染后，最初叶片出现白色粉状斑点，后病斑扩大或相连成片，发病后期叶面布满白色粉层，叶片变褐，严重影响观赏价值，甚至导致植株成片死亡。发病后期在发病部位形成的小黑点即为病菌的闭囊壳。据以前的研究报道有2个属的白粉菌引起百日菊的白粉病，分别是白粉菌属（Erysiphe）和单丝壳属（Sphaerotheca），属于子囊菌门（Ascomycota）白粉菌目（Erysiphales），白粉菌科（Erysiphaceae）[4-7]。 白粉菌传统的鉴定以其形态学为主要特征，如有性世代闭囊壳内子囊的个数及子囊孢子的数目，闭囊壳外附属丝的特征等，但传统的分类特征有诸多不足之处[8-11]。近年来，分子生物学在植物病害鉴定上的应用越来越广泛，特别是植物病原菌在rDNA的内转录间隔区（internal transcribed spacer，简称ITS）既具有保守性，又在科、属、种水平上均有特异性序列的特点，通过特异性引物对ITS区段进行PCR扩增，可用于快速鉴定、检测植物病原菌以及病害的诊断等[12-13]。目前国内关于百日菊白粉病病原菌分子分类系统的研究未见报道，通过提取百日菊白粉菌总基因组DNA，利用分子生物学技术对其分类特征及进化关系进行研究，可为该花卉白粉病的准确调查提供有效和实用的手段。 1 材料与方法 1.1 试验材料 白粉菌样本于2017年8月12日采自黑龙江省哈尔滨市东北林业大学城市实验林场，样品编号为BC180623，寄主植物为百日菊。提取白粉菌基因组DNA的试剂盒购自盛泽生物试剂有限公司（目录号：DP321）。 1.2 试验方法 1.2.1 样品白粉菌的收集 刀片轻轻刮下叶片表面的菌丝与闭囊壳混合物，放入2 mL离心管中，置于-4 ℃冰箱中保存。 1.2.2 基因组DNA的提取 采用试剂盒法提取百日菊白粉菌基因组DNA：（1）取适量白粉菌菌丝放入研钵中，加入液氮充分研磨;（2）加入400 μL缓冲液FP1和6 μLRNaseA（10 mg/mL），涡旋振荡 1 min，室温放置10 min;（3）加入130 μL缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1 min，12 000 r/min离心 5 min，将上清液转移至新的离心管中，重复这一步骤;（4）向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，此时出现絮状基因组DNA，离心2 min，弃上清，保留沉淀;（5）加入700 μL 70%乙醇，涡旋振荡5 s，12 000 r/min离心2 min，弃上清，重复这一步骤;（6···试读结束