酶的纯化方法.ppt

3 超离心分离法 原理:这是利用样品中不同大小的分子在相对离心力场达80，000一250，000g的条件下分布不同而进行分离纯化的一种方法。 应用:此法主要用于病毒、细胞颗粒体等的制备，对分子量较小的酶或蛋白质分离效果一般不佳，分辨率不高而且费时. 第三十页，共八十二页，2022年，8月28日 五.根据解离电学性质的特点建立的纯化方法: 1.吸附交换(层析)法; 2.电泳法; 3.聚焦层析法。 第三十一页，共八十二页，2022年，8月28日 1 吸附交换(层析)分离法 这是最常用的一类纯化方法。 原理:利用待纯化样品中不同的分子和吸附剂间的吸附与解吸性质的不同而达到分离。这类分离或以静态吸附方式进行，或以层析吸附方式进行。 过程:有三个主要环节：加样吸附、洗涤和洗脱。实际上每一个环节都包含目的酶和杂蛋白的分离，因此是一种十分有效的纯化方法。 第三十二页，共八十二页，2022年，8月28日 吸附交换分离法原理示意 第三十三页，共八十二页，2022年，8月28日 吸附剂:根据吸附机制的不同可分为三种类型： 1.“传统”的物理吸附剂; 2.羟基磷灰石; 3.离子交换吸附剂。 第三十四页，共八十二页，2022年，8月28日 (1)物理吸附 传统的物理吸附剂常用的有白土、氧化铝和磷酸钙胶等。其中白土是以硅酸铝为主要成分的具有强吸附力的一类粘土，包括皂土、高岭土和活性白土等；氧化铝根据制备方法不同有多种成品，磷酸钙胶可从氧化钙和磷酸三钠直接制备。 物理吸附的原理: 一般认为它是由于吸附剂界面分子和样品分子间相互作用的范德华力所引起；因而选择性不强预见性较小，往往需要通过实验加以确定。 这类吸附剂应用很早，但没有得到更大的发展，原因可能也就在于此。 第三十五页，共八十二页，2022年，8月28日 (2)羟基磷灰石吸附： 近年来应用羟基磷灰石作为吸附剂的日期增多，它是一种微晶型的磷酸钙制品。 原理: 一般认为是，这种晶体表面的钙离子能和蛋白质的负电性基团相互作用，而磷酸基团则能和正电性基团结合。如果在系统中有对钙亲和力更强的离子(如柠檬酸盐)存在时，羟基磷灰石对蛋白质的吸附能力就会显著下降，但是其它盐如NaCl等，即使浓度很高，也不会影响蛋白质的负电性基团和钙之间的结合。反之，这些盐可以大大降低正电性基团的作用，也就是说在盐浓度很高的溶液，羟基磷灰石可用来吸附酸性或中性蛋白，而排除碱性蛋白，这样就可以省去吸附前的脱盐透析平衡。羟基磷灰石对蛋白质的吸附容量比较高，在一般吸附操作条件下约50克／升床体积。 第三十六页，共八十二页，2022年，8月28日 (3)离子交换吸附 原理:这类吸附是在蛋白质的解离基团与离子交换剂的解离基团之间的解离交换过程中进行的。由于各种蛋白质和离子交换剂在不同条件下有相应不同的解离状态，因此通过选择适当的交换剂、控制交换和洗脱条件，就可将酶和杂蛋白分离开来。 第三十七页，共八十二页，2022年，8月28日 分类:离子交换剂包括两个部分：载体和离子交换基团。 常用的吸附剂有：离子交换树脂、离子交换纤维素和离子交换凝胶。离子交换树脂是以交联的聚苯乙烯树脂等为载体，再导入相应的解离基团而成;离子交换纤维素是目前酶的纯化工作中用得最多的交换剂，它是以亲水的纤维素为载体，在引入相应的交换基团后制成的; 离子交换凝胶以葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶为载体，导入相应的交换基团后制成。 第三十八页，共八十二页，2022年，8月28日 按离子交换基团分类: 离子交换基团是交换剂表现功能的基础，它的性质决定交换剂的类型与强弱。带阳电荷解离基的交换剂在离子交换过程中能吸附荷阴电的离子，故称为阴离子交换剂；反之，带阴电荷解离基的交换剂可对付荷阳电离子，称为阳离子交换剂。 第三十九页，共八十二页，2022年，8月28日 离子交换剂的选择依据： 首先是待分离酶(或蛋白)的稳定性; 其次是强型和弱型交换剂的选择; 第三是交换容量,交换容量有两方面的含义,一为总的交换容量；一为实效交换容量。前者是指每克干离子交换剂上带有的总交换基数目，其中包括潜在的交换基；后者是指特定的实验条件下实际可用于交换的交换基数目; 第四是流速,纤维素柱的流速一般低于凝胶。 第四十页，共八十二页，2022年，8月28日 待分离酶(或蛋白)的稳定性的选择: (i)如果待分离的酶在低于其pI的pH条件下稳定，则可选用阳离子交换剂; (ii)如果待分离的酶在高于其pI的pH条件下稳定，则采用阴离子交换剂; (iii)如果待分离的酶在高于和低于其pI的pH条件下都稳定，则两种交换剂都可以考虑