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外源基因表达与基因工程药物;DNA克隆、测序与重组技术的历史;重组DNA技术的发展史;重组DNA技术;一、重组DNA技术相关概念;技术水平:分子克隆(molecular clone)
(即DNA 克隆)
细胞克隆
个体克隆(动物或植物) ;应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质(同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA)与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon),继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增提取获得大量同一DNA分子,也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 ;生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等;(二)工具酶;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶
(restriction endonuclease) ;与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统,限制外源DNA,保护自身DNA。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写;
第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写;
第四个字母代表株;
用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;来源不同的限制酶,但能识别和切割同一位点,这些酶称同功异源酶。;有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同,但切割DNA后,产生相同的粘性末端,称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。;名 称 识别序列及切割位点;二、DNA连接酶
三、DNA聚合酶
四、修饰酶
1、末端转移酶
2、碱性磷酸酶
3、T4多核苷酸激酶
4、DNA甲基化酶;目的基因(target gene) ;基 因 载 体;克隆载体(cloning vector)
为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。;载 体 的 选 择 标 准;可接合质粒如 F 因子(F factor) ;质粒 (plasmid);质粒载体分类;第二十七页,共八十二页,2022年,8月28日;pBR322载体特点;第二十九页,共八十二页,2022年,8月28日;pUC系列载体特点; λ噬菌体DNA改造系统
λgt系列(插入型,适用cDNA克隆)
EMBL系列(置换型,适用基因组克隆);粘性质粒(cosmid);
粘 性 质 粒
也称柯斯载体。是带有粘性末端位
点的质粒, 柯斯质粒是人工建造的的含有
λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊
类型的质粒载体。
;粘 性 质 粒;粘 性 质 粒; 酵母人工染色体
(yeast artificial chromosome, YAC)
细菌人工染色体
(bacterial artificial chromosome, BAC)
动物病毒DNA改造的载体
(如腺病毒,腺病毒相关病毒,逆转录病毒);重组DNA技术基本原理; 以
质
粒
为
载
体
的
DNA
克
隆
过
程;(一)目的基因的获取;化学合成法获取目的基因;组织或细胞染色体DNA;;mRNA ;(二)克隆载体的选择和构建;(三)外源基因与载体的连接;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点(非配伍末端)的连接;平端连接 ;目的基因;在末端转移酶(terminal transferase) 的作用下,在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端,再进行粘端连接。;5′
3′;由平端加上新的酶切位点,再用限制酶切除产生粘性末端,而进行粘端连接。 ;人工接头及其应用;受体菌条件:
安全宿主菌
限制酶和重组酶缺陷
处于感受态(competent) ;转 化 作 用;例:溶菌时,裂解的DNA片段被另一细菌摄取。;转 导 作 用;常 用 转 化 方 法;1. 直接选择法
(1) 抗药性标记选择
(2) 标志补救(marker rescue)
(3) 分子杂交法
原位杂交
Southern印迹
2. 免疫学方法
如免疫化学方法及酶免检测分析等;(插入失活法)
抗药性标记选择; α互补;第六十二页,共八十二页,2022年,8月28日; 原 位 杂 交; Southern印迹;鸡的β肌球蛋白的克隆和检出;重组DNA技术操作过程可形象归纳为: ;重组DNA技术操作的主要步骤;第 四 节;表达体系的建立:
表达载体的构建
受体细胞的建立
表达产
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