荧光PCR原理及应用.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * Taqman原理： 除常规的一对引物以外，PCR反应体系中另加有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5’端标记一个荧光基团，3’标记另一个荧光基团。此时5’端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光基团（发生FRET），因此正常情况下该探针检测不到的5’端荧光基团发出的荧光信号。但当溶液中有模板时，模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换；激活Taq酶的5’外切酶活性，将探针5’端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而受光刺激激发出荧光，切割的荧光基团数与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。 * * * * * * * * * * * * Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 * * * * Standard Curve(标准曲线)：CT/TC/CP与起始模板量的对数呈反比关系： Y=-aX+b 其中X=Log Concentration Y=CT/TC/CP PCR扩增过程中，引入一系列已知起始浓度的模板与未知样品同时进行扩增，利用该系列模板的CT/TC/CP值与已知浓度对数做直线回归得到标准曲线，从而计算出未知样品的起始模板浓度。 * * * * 定量PCR（quantitative PCR） 用PCR方法定量主要有两种： 终点定量（end point PCR）在PCR循环结束后对PCR扩增产物进行测定量化，而PCR到达平台期时检测重现性差，无法准确定量。 对数期定量（Log phase PCR）在PCR的对数增长期对PCR扩增产物进行测定量化，最大定量范围可达到10个数量级，如荧光定量PCR。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 内标工作原理图 第三十页，共五十五页，2022年，8月28日 荧光PCR在临床诊断上的应用 第三十一页，共五十五页，2022年，8月28日 荧光定量PCR的临床应用 早期诊断 病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证 输血源的筛选 母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断 第三十二页，共五十五页，2022年，8月28日 疾病的早期诊断 免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口期”，比如HCV的“窗口期”平均长达70天，不利于对疾病的早期诊断；PCR方法直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。 第三十三页，共五十五页，2022年，8月28日 HBV DNA与血清免疫学的关系 HBV DNA 与HBsAg/ HBsAb的关系HBsAg（+）HBV DNA（-）：病毒基因的整合，此时只能表达HBsAg，而没有DNA的复制；操作失误；PCR试剂的灵敏度不够。HBsAg（-）HBV DNA（+）：“窗口期”；HBsAg 的水平过低无法检出，或者HBsAg确已消失但病毒仍处于低水平复制状态；暴发性乙肝以合成HBcAg 为主，很少或不合成HBsAg；S区基因发生逃避免疫变异造成HBsAg阴性而HBV DNA阳性；血清亚型的漏检；老年人HBsAg检出率低于5%，HBsAb（+）通常表示病毒已清除。但已有报道HBsAb出现后血清内仍有DNA复制，尤其急性乙型肝炎感染窗口期HBsAb与HBV DNA同时阳性，但通常HBV DNA检出率逐步下降 HBV DNA 与HBeAg/ HBeAb的关系HBeAg阳性与HBV DNA有显著相关。HBeAg 阴转往往是HBV病毒血症的消失或炎症的静息。通常认为HBeAg转阴继而出现HBe抗体的转化为乙型慢性肝炎好转稳定的标志。事实上部分感染者中如慢性肝炎，HBeAg阴转并不意味着炎症活动的停止。HBeAg阴性的HBV感染；在另一部分感染者中如重型肝炎患者，主要以HBcAg的表达为主，感染起始即为HBeAg阴性。 第三十四页，共五十五页，2022年，8月28日 病毒感染窗口期的NAT检测 第三十五页，共五十五页，2022年，8月28日 Lam et al - Hepatol 26: 226, 1997 对病毒感染的药物治疗中，免疫学指标的变化通常比较滞后出现，且受个体差异影响较大，从而对临床判断难以及时提供直接证据；而荧光定量PCR检测可直接反映病原体滴度是否受药物治疗发生变化，从而为药物疗效观察提供直接依据，以供治疗方案参考。同时对不同治疗时间的用药剂量和用药时间提供依据