生物化学技术1生命大分子物质的制备.pptxVIP

第一章 生命大分子物质的制备第一页，共六十四页。生命大分子物质 是指动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生的蛋白质(包括酶)和核酸等有机化合物的总称 第二页，共六十四页。 蛋白质和核酸类物质是本学科的主要研究对象，而它们往往与其他物质结合在一起，或蛋白质和核酸相互组合而一起出现，加之它们含量低、离体后稳定性较差，使得提取分离过程变得困难；尽管如此，制备生命大分子物质的程序还是存在不少共同之处第三页，共六十四页。目 的掌握材料的选择与处理及确立测定方法掌握细胞的破碎、抽提、浓缩熟悉纯化方案的设计与评价第四页，共六十四页。第一节 材料的选择与处理第五页，共六十四页。一、材料的选择第六页，共六十四页。有效成分的定义是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质第七页，共六十四页。生物材料的特点有效成分含量一般较低有效成分稳定性较差 选用的材料不同，有效成分的含量就不同；即使选用的材料相同，不同的部位和生长时期，其有效成分的含量也不尽相同第八页，共六十四页。材料选择原则有效成分含量高，稳定性好材料来源丰富，保持新鲜提取工艺简单有综合利用价值 实际工作中，不能硬套原则，要视实际情况而定第九页，共六十四页。二、材料的处理 对于生物材料，应及时使用，否则有效成分会部分甚至全部被破坏，影响得率 若处理不当，会严重影响有效成分的产量和质量第十页，共六十四页。（一）动物脏器◆冰冻：去除脂肪和筋皮等非有效部位，-10℃或-70℃ 冰冻储存◆干燥：◇小量（如垂体等小组织）可用丙酮脱水干燥 ◇对于耐高温的有效成分（肝素），其材料可用沸 水蒸煮处理，烘干后保存第十一页，共六十四页。除脂方法人工剥离用脂溶性有机溶剂脱脂热处理冷藏法（速热到50 ℃左右，然后速冷却），使其结块而除去运用油脂分离器分离第十二页，共六十四页。（二）植物组织 茎叶等洗净即可使用，或快速放置-4~30℃储藏备用；若为种子，则需泡胀或粉碎才使用（油脂较多的也需脱脂处理）第十三页，共六十四页。（三）微生物 由于具有种类多、繁殖快、培养简单、诱变容易和不受季节影响等优点，现已成为制备生命大分子物质的主要材料之一 上清：制备胞外酶和辅基等成分培养液 离心 菌体：破壁后提取胞内成分第十四页，共六十四页。 第二节 确立测定方法 第十五页，共六十四页。一、目的要求目的：1.确定生物材料 2.确定提取纯化方法的有效性要求：方法简单、灵敏、专一性强（因为抽提液和纯 化的前阶段溶液中有效成分的比活低而杂质的种 类多且含量高）第十六页，共六十四页。 常用的测定方法 光谱法 ：包括吸收光谱法、荧光法、浊度法电化学法 生物活性检测法 免疫分析法 生物传感器 第十七页，共六十四页。（一）光谱法特点：所需样品量少，操作简单，反应迅速，灵敏（10-7）。 广泛用于蛋白质含量的测定第十八页，共六十四页。1.吸收光谱法直接测定：将待测物配成一定浓度的溶液，在一定波 长处用分光光度计测定其含量如测定核酸含量：双链DNA：50μg/ml；单链DNA：３７μg/ml；　单链ＲNA：４０μg/ml；A260=1 纯度测定:纯DNA A260/A280 =1.8;纯RNA A260/A280 =2.0 (若DNA A260/A280 <1.8或<2.0,说明有蛋白质混入)第十九页，共六十四页。比色法:将待测物与相关试剂或酶的底物作用产生具有 特定颜色的物质,通过测定有色物质的A值对待 测物定量或测定酶的活性第二十页，共六十四页。2.荧光法特点：精确、灵敏（10-9~-10）、重复性好AST如AST的测定：ASP+α-酮戊二酸 草酰乙酸+Glu 草酰乙酸+NADH+H+L-苹果酸+NAD+ AST活力测定就是通过测定在340nm（NADH）处的A值下降量MDH第二十一页，共六十四页。3.浊度法主要对稀悬浮液进行测定如：半刀豆球蛋白活力测定 —A420 培养液中细菌浓度测定— A600第二十二页，共六十四页。（二）电化学法用pH计或酸碱滴定进行测定第二十三页，共六十四页。（三）生物活性检测法 根据生命活性物质用于实验动物身上引起的变化对生命活性物质进行检测 如：HCG能使小鼠子宫加速增殖，故通过注入HCG后检测小鼠子宫的变化来推测HCG 的生物活性第二十四页，共六十四页。（四）免疫分析法 利用Ag-Ab特异反应，并结合放射性同位素标记或酶标记，对有关物质灵敏定性或定量 如：酶联免疫吸附法第二十五页，共六十四页。（五）生物传感器 利用生物传感器的 敏感膜与待测液中某一成分进行反应，来显示有效成分的数量第二十六页，共六十四页。 几种测定蛋白质和核酸含量的方法第二十七页，共六十四页。 第三节 细胞的破碎 第二十八页，共六十四页。 有效成分有的存在于“材料”细胞外，有的