《western blot失败经验总结》.pdf

精品文章 《western blot 失败经验总结》 第一篇。westernblot失败经验总结westernblot失败经验总结 1 我做了很久的 wb，最大的一个难点感觉在于样品制备上。蛋白的降 解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事 ~~ 如果单独做wb 的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原 则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loadingbuffer裂 解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loadingbuffer100度充分变性， 再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。 另一个感觉就是样品中目的蛋白的量，限于wb的检测下限问题， 一般目的蛋白量最好别低于1ng（虽然ecl法下限是0.1ng，即100pg）， 最好在 10ng 以上为好。这就要求在做wb 之前必须充分考虑目的蛋 白的可能丰度，最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量， 千万别把样品搞稀了，否则就不好办了。 最后，还是多看文献，在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做 的，有什么特殊要求，内参如何选等等。 westernblot 失败经验总结 2 我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体 会 1、跑胶电泳buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候 能用个3－4 次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看 气泡的均匀度；buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白 不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不 要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的 精品文章 蛋白； 2、转膜我用的是湿转，buffer 一定要预冷，最好提前一天配好 放4度；滤纸不要大过pvdf膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极， 放入 tank 前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好 正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。 ＷＥＳＴＥＲＮＢＬＯＴＴＩＮＧ心得 １.总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）： 组织匀浆后，15000g，4度，20分钟后，取.buffer：np40750ul， 脱氧胆酸钠 0.5 克，sds0.1 克，加 1xpbs 至 100ml.再加入 pmsf （7.4mg/ml）0.1ml. （现用现加）7.4mg/mlpmsp 异丙醇溶液：取 amgpmsf加a/7.4ml异丙醇.工厂-20度储存２.组织膜蛋白提取：所在 操作冰上进行 （1）取组织，用pbs冲洗干净组织上的血液.加入10mlbuffera， 用剪刀尽可能剪碎组织，于冰上充分匀浆。每次30秒，重复3-5次. （2）离心机1000rpm，4℃离心10min后，所得液转入超速离心管。 （去掉大块组织及结缔组织）（3）100000g，4℃离心1hr，弃去. （此 为胞浆蛋白，若只提取胞浆蛋白，可用10000rpm，4度，30分钟离 心，取即可）。沉淀用适量的bufferb重悬，4 度过夜后，分装至 ep 管，eppendorf 台式离心机10000rpm，4℃离心30min。（4）收集所 得液即为膜组份。 buffera。0.32m蔗糖，5mmtris-hcl（ph7.5），120mmkcl，1mmedta， 1mmegta ， 0.2mmpmsf ， 1ug/mlleupeptin ， 1ug/mlpepstatina ， 精品文章 1ug/mlaprotinin。冰上预冷。bufferb20mmhepe （ph7.5），10%甘油， 2%tritonx-100，1mmedta，1mmegta，0.2mm，pmsf，1ug/mlleupeptin， 1ug/mlpepstatina，1ug/mlaprotinin。冰上预冷。所得蛋白分装ep 管 （每管约50ul），取一管测蛋白浓度，其它放入-70度深冻冰箱保存。 如果要定量的话，最好能立即根据浓度，加入上样缓冲，煮沸，4度 保存。反复冻融蛋白会降解，浓度不准。 考马斯亮兰Ｇ２５０测蛋白浓度： 考马斯亮兰Ｇ２５０配方。g2500.4克，95%乙醇100ml，85%磷 酸200ml，加水至xxml，过滤后使用。 bsa标准液。0.5mg/mlbsa，双