课件一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能.ppt

* * 样品制备的基本原则 样品前处理---荧光标记---上机观察 荧光标记 染料直接染色：生物样品与荧光探针直接作用，使样品具有荧光。 免疫荧光：是将抗体标记上荧光素与细胞或组织内相应的抗原结合后，通过观察检测特征的荧光，定性、定位及定量的检测样品中的抗体。 表达荧光蛋白：跟踪活组织或细胞内基因表达及蛋白定位的标记物。 免疫荧光 直接标记：一抗上带有荧光探针 间接标记：二抗上带有荧光探针 第六十二页，编辑于星期六：五点 四分。 样品制备的基本原则 上机观察前的注意事项： 尽快上机采集图像，防止荧光泄漏、荧光淬灭及样品干燥等导致的荧光变化。 封片： △ 防止样本变形 △ 防止荧光褪色 △ 用于LSCM的盖玻片厚度应为0.17mm 在用激光共聚焦显微镜观察前，先用普通荧光显微镜观察有无信号。 样品前处理---荧光标记---上机观察 第六十三页，编辑于星期六：五点 四分。 样品的阴性对照： 病变组与非病变组 药物处理的阴性对照：加药组与未加药组 荧光染色剂的阴性对照：未加一抗的荧光二抗 组与未加荧光染料组 设立阴性对照 样品制备的基本原则 第六十四页，编辑于星期六：五点 四分。 样品制备的基本原则 设立阴性对照 第六十五页，编辑于星期六：五点 四分。 1.简述激光共聚焦显微镜的工作原理。2.简述激光共焦显微镜与荧光显微镜的差别。它有哪些优缺点？ 3.简述激光共聚焦显微镜的功能。  思考题 第六十六页，编辑于星期六：五点 四分。 美图赏析： 尼康微观世界显微摄影大赛 / 奥林巴斯杯显微图像大赛 MD显微成像应用大赛/ 扩展内容 李真 西七103 第六十七页，编辑于星期六：五点 四分。 * * * 今天我们介绍一下激光共聚焦显微镜的工作原理和应用实例。首先介绍一下激光共聚焦显微镜的定义，以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。其中以“激光、共轭聚焦、断层扫描和荧光显微镜”为关键。下面我们就分别介绍这几个关键词，以更好的理解这个定义。 * * * * 这是一个普通的光学显微镜，它的工作原理是：底部的光线照射到载物台上的样品，光线再透过物镜，最终被我们观察到。显微镜能将微小的不可见或难见物品放大，从而方便观察的工具。 * * 荧光显微镜就会用于观察荧光或荧光标记物质的光学显微镜，与普通显微镜不同的是，它的光源主要由汞灯或者卤素灯激发，发出的光源首先经过一个分光镜，这个分光镜的作用是长通短反，即让长波长的光线透过分光镜，而短波长的光线被分光镜反射进入物镜，照射到标记了荧光的样品上，样品上的荧光被激发以后，又通过物镜最终被人眼或者CCD等设备观察到，成像。 讲完荧光显微镜工作原理后，但是由于 在传统的荧光显微镜中，来自汞灯或者氙灯的激发光照射视野中的全部样品，观察者可以用眼睛直接观察，也可以用CCD等设备直接拍摄荧光图像。 传统显微镜得到的图片容易受到轴向干扰和侧向干扰的影响而显得有些模糊。 不能满足人们需要—先讲影响成像因素 将LCSM的优点 * * 普通显微镜成像原理：随机选择标本上三个点，其中蓝色点位于透镜的焦点上，标本上的三束光经过透镜后，只有蓝色光聚焦，此时在焦平面上成像，只有蓝色点形成一个清晰的图像，而红点和黄色只形成模糊像。正是由于有这些轴向和侧向光线的干扰，使图像模糊。这也正是传统荧光显微镜成像中存在的缺陷。那么如果将这些非焦面上的光线阻隔掉，只收取焦平面上的图像信息，这将会大大提高图片的清晰度。这也就是共聚焦显微镜成像清晰的关键技术之一。这个能将光线阻隔掉的元件即为针孔，它类似于一张CD光盘，中间有个小孔，只允许焦平面上的光线透过。 比较下面两幅图像，尽管荧光显微镜图片已经能看到荧光信号的分布和组织结构，但是一些细节缺表现的不如激光共聚焦。 * * 今天我们介绍一下激光共聚焦显微镜的工作原理和应用实例。首先介绍一下激光共聚焦显微镜的定义，以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。其中以“激光、共轭聚焦、断层扫描和荧光显微镜”为关键。下面我们就分别介绍这几个关键词，以更好的理解这个定义。 * * 激光作为光源的优势 激光共聚焦和荧光显微镜成像区别 * * 再继续比对一下荧光显微镜和激光共聚焦显微镜的光学原理。 荧光显微镜的光学原理是：光源从汞灯射出，经过分光镜短波长的光被反射进入物镜照射到标本上，使标本上的荧光物质被激发。这些激发光再透过物镜被检测器（CCD或者是人眼）获取而成像。 激光共聚焦显微镜：在光源处有个光源针孔，它所在的位置是在物镜的焦点上，经过该针孔的光源可认为是