兽药小鼠骨髓细胞微核试验指导原则.docxVIP

兽药小鼠骨髓细胞微核试验指导原则 一、概述 （一）定义与目的 微核试验是通过测量微核率来评价染色体损伤的一种细胞遗传学方法。微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然滞留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在细胞的胞质中，由于比核小得多故称微核。这种情况的出现往往是受到染色体断裂剂作用的结果。另外，也可能在受到纺锤体毒物的作用时，主核没有能够形成，代之以一组小核。此时小核往往比一般典型的微核稍大。 微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。由于红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时内可将主核排出，而仍保留微核于嗜多染红细胞（PCE）中，因此通常计数哺乳动物骨髓PCE的微核。为了确保小鼠骨髓细胞微核试验结果的真实性、可靠性和可追溯性，根据新 兽药研究的规律，结合国内兽药毒理学评价的实际情况制定了本指导原则。 （二）适用范围 本指导原则适用于兽用化学药品、中兽药、消毒剂及饲料药物添加剂的哺乳动物体细胞遗传毒性检测。 二、试验设计 （一）材料与方法 1.实验动物 SPF小鼠，7～12周龄，体重25～30g，100只左右，雌、雄各半。2.试剂 致突变阳性对照物 环磷酰胺，分析纯以上，含量不低于98.5%。 其他试剂甲醇：分析纯； 甘油：分析纯； 磷酸二氢钾：分析纯； 磷酸氢二钠：分析纯； 姬姆萨（Giemsa）染料：分析纯； 小牛血清：分析纯。 过滤除菌后放入56℃恒温水浴中保温1h进行灭活。储存于4℃冰箱或冰盒里备用。 Giemsa 贮备液配制 称取Giemsa染料3.80g于研钵中，加入375 mL甲醇（分析纯）一起研磨，待完全溶解后再加入125 mL甘油。移入试剂瓶内，置37℃恒温箱保温48h，其间振摇数次, 两周后过滤可用。 （4）1/15mo1/L 磷酸盐缓冲液（pH6.8）配制 分别称取磷酸二氢钾（KH2PO4）9.08g和磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O） 23.88g，加蒸馏水980mL溶解，用酸度计调整pH至6.8，转入1000mL容量瓶，用蒸馏水定容至1000mL。 （5）Giemsa 工作液配制 取1份Giemsa贮备液与6份1/15mo1/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）混合即成，临用时配制。 3.仪器设备 台式离心机 生物显微镜（带 100×油镜头） 恒温水浴（温控误差士 0.5℃） 细胞计数器 解剖器械、载玻片、注射器、灌胃针头等实验室常用仪器设备 （二）试验步骤 剂量组设计 设3个剂量组，即1/2LD50 、1/4LD50、1/8LD50，当受试药物LD50大于5000mg/kg （或mL/kg）时，试验组高剂量设为5000mg/kg（或mL/kg），将2500mg/kg（或mL/kg）和1250mg/kg（或mL /kg）分别设为中剂量和低剂量；另外设1个阴性(溶剂)对照组和1个阳性对照组。阳性对照物可选用环磷酰胺，剂量为40mg/kg体重， 经口给予。每组小鼠16只，雌、雄各半，确保给药后雌、雄小鼠至少各存活5只供采样、制片。 受试药物溶液配制 根据受试药物理化性质，选定溶剂，将受试药物配制成水溶液（或乳化剂、混悬液、糊状物等）。必要时加入增溶剂或助悬剂（如吐温-80、淀粉、羧甲基纤维素钠等）。 各剂量组受试药物溶液可采用2倍递次稀释法配制。根据受试药物的小鼠LD50，按小鼠0.1～0.2mL/10g体重受试药物给予体积要求，先确定1/2 LD50剂量组（即高剂量组）受试药物溶液需配制的浓度，再确定各剂量组所需受试药物溶液体积，以及将1/2 LD50剂量组受试药物溶液作为初始溶液需配制的体积，计算配制溶液时需称取/量取受试药物的量。 用天平或移液管，称取或量取受试药物置烧杯内，加入适量选定的溶剂溶解或稀释，转入容量瓶内，混匀并定容，即获得1/2 LD50剂量组（高剂量组）所需浓度的受试药物溶液。用量筒分取1/2体积的溶液供1／2 LD50剂量组给药，向原溶液中加入同体积的溶剂，混匀后溶液正好是1/4 LD50剂量组（中剂量组）所需的剂量浓度；用量筒分取1/2体积的溶液供1/4 LD50剂量组给药，再加入同体积的溶剂，混匀后溶液正好是1/8LD50剂量组（低剂量组）所需的剂量浓度，可供其给药。 试验动物称重、标记编号和分组 将购置的小鼠饲养观察1周。选择健康雌、雄小鼠各40只，分别进行标记编号和称重，采用完全随机法，分别将雌、雄小鼠分为5组，每组雌、雄各8只。 给药 按受试药物给予要求，采用灌胃（或注射）给药，给药两次，两次给药间隔24h。每次给药先称取小鼠体重， 按0.1～0.2mL/10g要求给予小鼠受试药物剂体积，用注射器吸取受试药物溶液通过灌胃（或注射）对各小鼠进行给药。 标