教案-植物总DNA的提取.doc

植物总 DNA 的提取及检测 一、 实验目的 学习 CTAB 法从植物叶片中提取 DNA 的原理； 认识植物总 DNA 的提取及检测方法； 认识各仪器的使用方法及注意事项。 二、 实验原理 核酸与蛋白质结合在一同以核蛋白的形式存在。 在制备核酸时往常损坏细胞 壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。 CTAB 是一种阳离子去垢剂，它能够溶解膜与脂膜，使细胞中的 DNA- 蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使 DNA 与蛋白质分别， 再用氯仿 -异戊醇将蛋白质积淀除掉。由于 DNA 溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂， 可向含有 DNA 的水相中加入冰乙醇， DNA 即呈纤维状积淀出来。 通过琼脂糖凝胶电泳初步判断所得 DNA 的大小及优劣，同时利用分光光度 法分别测出在 230nm、260nm、280nm 处的吸光值并根据比率得出所提 DNA 的 浓度及纯度。 三、 实验器材 新鲜的蒲公英叶片 电子天平 研钵或匀浆器 水浴锅 离心计 不同量程的移液器及枪头 核算蛋白测定仪 电泳仪及电泳槽 凝胶成像系统 四、 实验试剂 CTAB 提取液（0.1mol/L Tris-HCl pH8.0, 0.1mol/L EDTA pH 8.0, 2% CTAB, 1mol/L NaCl, 2%DTT, 3% PVP ） 2. TE 缓冲液 (10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH8.0) 或双蒸水 氯仿：异戊醇 (24:1) 无水乙醇及 70%乙醇 琼脂糖及 TAE 缓冲液 五、 操作方法 称取 500mg 新鲜蒲公英叶片（采集后冲洗晾干并低温保留） 置于研钵中，加一小药匙石英砂及 4mL CTAB 提取液 ,快速研磨。 将研磨液均匀转移至 1.5mL 离心管内，每管约 1mL ，置于 65℃水浴中保温 20min，其间颠倒混匀 2－3 次。 4℃， 12000r/min, 5min,取上清至新的离心管中，约 700μL 加等体积的氯仿 /异戊醇（ 24:1），充足颠倒混匀。 4℃， 12000r/min，离心5min，取上清。为充足除掉蛋白质，往常需要重复该步骤。 将上清加入 2 倍体积的无水乙醇（ -20℃预冷），颠倒混匀，可见白色絮状积淀，即 DNA 。 -20℃静置 20min。 4℃， 12000r/min，离心 10 min，倒掉上清，用 70%乙醇洗涤两次后倒掉乙醇并风干。 溶于 50-80μL TE 溶液，使其充足溶解。 配制 0.8%的琼脂糖凝胶，取 4μ L DNA 溶液及 1μL 含有核酸染料的 loading buffer，在 TAE 缓冲液中以 90 V 的电压电泳 1h，并用凝胶成像系统进行拍照。 取 2 μL DNA 提取液稀释 100 倍，以 TE 作为空白比较，利用核酸蛋白测定仪测得 DNA 样品的浓度，以及在波长 230nm、260 nm 和 280 nm 处 的吸光值，通过相应比率能够判断 DNA 的纯度及提取效果。 六、 作业 达成实验报告（绘制电泳图谱，并记录 DNA 浓度及纯度）