《分子生物学检验技术》第八、九、十章 感染性疾病的分子生物学检验.ppt

全国累计报告HIV感染者地理分布 截至2013年9月30日,全国共报告现存艾滋病病毒感染者约43.4万例 HIV在宿主细胞中的复制 Step 1: Binding Step 2: Reverse Transcription Step 3: Integration Step 4: Replication Step 5: Translation Step 6: Viral Assembly 靶细胞：CD4+ T 细胞 HIV基因组 基因组为RNA双分子，与其它逆转录病毒基本相同 其正链RNA分子大小为 HIV-1 9.3 kb 有3 组共8个基因 HIV-2 9.7 kb 有3 组共9个基因 5’端有帽子结构，3’端有poly(A)结构 HIV基因组 第一组：逆转录病毒共同的结构基因和侧翼末端重复顺序（long terminal repeats） gag（group of antigen)基因：编码核心蛋白 pol （polymerase）基因：编码逆转录酶，DNA聚合酶 env（envelop）基因：编码包膜蛋白 LTRs：不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性 第二组：参与基因表达的调节基因 　tat（trans-acting transcriptional gene） 　 rev（regulator of expression of viral protein） 　 nef（negative regulator factor） 第三组：负调控病毒的感染性，成熟或释放的基因 　vif（viral infectivity factor） 　　vpu（viral protein U） 　 vpr（viral protein R） HIV基因组遗传变异率高 高度变异区在env基因内，相当于gp120的五个区段，gag和pol基因较少变异，是基因组的保守区域 HIV疫苗研发难度大 HIV-1感染后病毒标志物的变化 窗口期： 检测抗体 2-12周 检测p24抗原 2-3周 检测RNA 11天 HIV检测的分子生物学检验 HIV抗体检测（窗口期测p24抗原，可辅助诊断 ） 初筛试验：酶联免疫吸附试验（ELISA） 试纸（金标试纸，双抗原夹心法） 最短在感染6天之后就可以检测到 确认试验：免疫印迹（Western blot, WB） HIV RNA 定性测定方法： RT-PCR 基因芯片技术 集合核酸定性检测 原位杂交 HIV病毒载量（HIV RNA 定量） 主要有三种技术： RT-PCR（最低检测限为50copies/ml ） bDNA（最低检测限为50copies/ml） NASBA（最低检测限为20 copies/ml） NASBA（nucleic acid sequence-based amplification） 基于核酸等温扩增技术 PCR检测前病毒DNA，对出生48h内婴儿的检测敏感性为38%，出生14d婴儿的检测敏感性可为93% 方法 检测范围 实验内标准差（lg） 抗凝剂 RT-PCR 4?102-5 ? 0.15 ? 0.33 ACD/EDTA bDNA 4?102-5 0.08 ? 0.33 EDTA NASBA 4?102-5 0.13 ? 0.33 ACD/EDTA/HEP 人类免疫缺陷病毒的分型 HIV由于高错误率的逆转录酶、病毒的快速复制、宿主的免疫选择作用、不同毒株DNA之间的基因重组等原因，其基因具有很高的变异性。 目前，HIV分型的方法主要集中在env、gag和pol区的某一段基因片段的分析。常用方法有：序列分析法、异源双链核酸泳动实验、限制性片段长短多态性分析、DNA酶联免疫技术、基因芯片技术、多重PCR技术等。 人类免疫缺陷病毒的耐药性分析 耐药是抗病毒药物作用的病毒基因发生突变的结果。 HIV快速产生的耐药是影响治疗效果的主要因素。 已经确定的与6类艾滋病抗病毒药物耐药有关的HIV基因突变有200多个。 耐药性检测方法种类多，主要集中在耐药性突变位点的检测能力和耐药性突变位点的评价能力。 方法：基因芯片耐药检测、等位基因探针杂交、寡核苷酸链接分析法与直接测序法等。 分子生物学检验技术在很大程度上改变了感染性疾病的诊断方法 适用于检测不能或不易培养、生长缓慢的病原微生物，如结核分枝杆菌、苍白螺旋体、病毒等； 通过检测细菌16SrRNA基因或对其测序，对细菌进行种属鉴定，并可能发现新菌种；