《分子生物学检验技术》第6章蛋白质组学技术.ppt

* 是典型的“软电离”方式，没有直接的外界能量作用于分子，对分子结构破坏较少。 可形成多电荷离子，检测到大分子质量的分子。但主要用于测定多肽和蛋白质的分子量，不适于分析混合物样品。 在常规电喷雾质谱中，喷雾的过程易形成较大液滴，液滴中的样品分子不易完全离子化，从而降低样品的利用率和灵敏度。 3. 串联质谱 由离子源、多个质量分析器及碰撞室组成，对样品离子及其碎片进行连续分析，提供关于离子结构方面的信息。 离子源 四极杆质量过滤器 碰撞室 四极杆质量分析器 离子检测器 对混合物中目标化合物进行定性和定量分析 对多肽进行氨基酸序列和蛋白质翻译后修饰分析 * 4. 质谱仪的主要性能指标 分辨率（resolution, R）：质谱仪将不同值的离子分辨开的能力。 灵敏度：质谱仪可检测到的最小样品量。 质量测定范围 ：现代生物质谱仪检测的蛋白质分子量可达几十万 Da。 * 1. 考马斯亮蓝染色（ R-250 ） 最常用的蛋白质染色方法，与蛋白质的碱性基团可逆结合，使之着色。 * 优点：染色重复性好，操作简便，不影响后续的质谱鉴定。 缺点：灵敏度低于银染和荧光染色，不能满足对低丰度蛋白质的检测要求，样品用量大。 2. 银染色（不含戊二醛） 在酸性硝酸银溶液中蛋白质与银离子发生作用，然后在碱性pH条件下，银离子被甲醛还原成银颗粒沉淀在蛋白质上而呈显棕黑色。 优点：灵敏度高，是考马斯亮蓝染色法的100倍 缺点：操作繁琐，重复性不如考马斯亮蓝染色，对糖蛋白、钙结合蛋白的染色效果差。 * * 荧光染色 利用结合于蛋白质的荧光染料发出的荧光来检测蛋白质。目前商品化的荧光染料有SYPRO Ruby, Cy3, Cy5等。 优点：染色方法操作简便，灵敏度高达1～10ng，染色线性范围宽，对糖蛋白、脂蛋白染色效果好，不影响后续的质谱鉴定。 缺点：价格较昂贵，荧光易淬灭。 * 图片来自网络 （四）双向凝胶电泳图谱的计算机分析 确定蛋白质斑点的位置、大小、染色深浅、pI 和分子量； 图谱间的比较、差异蛋白质斑点的确定； 图谱质量的优化、数据的储存管理、数据库分析等。 * 1. 数字化双向凝胶电泳图谱的获取 利用图像扫描仪、数码照像系统、激光密度仪等将凝胶（或转印膜）上的蛋白质斑点图像转化成数字化的图像文件，这是进行计算机分析的前提。 * 2. 图像加工 对数字化电泳图谱作增强对比度、背景消减等处理，以消除背景染色。同时对图像的大小及方向进行调整，利于图谱间的比较。 * 3. 蛋白质斑点的检测 图像分析软件自动进行蛋白质斑点的识别，再经手工修正。 检测完成后，分析系统给出关于每个蛋白质斑点的编号、量值、峰值和位置等方面的信息。 * 4. 凝胶匹配（斑点匹配） 凝胶匹配是指通过比较两块（或多块）凝胶图谱，将图谱上对应的蛋白质斑点（代表同一种蛋白质）标识出来，称为匹配斑点；只在一块胶上出现的蛋白质斑点也标识出来，称为未匹配斑点，代表可能的差异表达蛋白质。 * 5. 数据分析 分析软件根据凝胶匹配的结果，对蛋白斑点进行分析，找出不同凝胶图谱间存在质变和量变的蛋白质斑点。 * * * 6. 双向凝胶图谱数据库 双向凝胶图谱分析产生成千上万的数据信息，现行的 2-DE 图像分析软件具有数据库支持功能，一个蛋白质在图谱中标示出来，即可在数据库中查到其相应的描述信息，如该蛋白质的名称、分子量、等电点等；反之，如果蛋白质的名称及其它信息已知，也可在图谱上显示斑点位置。 * * 图片来自网络 （六）双向凝胶电泳的分辨率、重复性及局限性 2-DE系统有很高的分辨率。 商品化的 IPG 胶条以及标准化的实验操作使得 2-DE 具有较高的重复性，可在不同实验室间进行图谱的比较。 * 2-DE 存在不足和缺陷： 分辨率仍不能完全满足蛋白质组学研究的需要。 难以有效分离极酸、极碱性蛋白质，极大、极小蛋白质，及低丰度蛋白质。 胶内酶解过程费时、费力，难以与质谱实现自动化联用。。 * 第三节 生物质谱技术 * 一、质谱（Mass spectrometry, MS）的基本原理 将样品分子汽化并电离成离子，通过测定离子的质荷比（m/z）和强度来进行定性和定量分析。 * * Inlet Ionization Mass Analyzer Mass Sorting (filtering) Ion Detector Detection Ion Source ? Solid ?