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;显示酶的组织化学方法
1.金属沉淀法:磷酸酶的显示
甘油磷酸钠 磷酸酯+铅 磷酸铅 硫化铅
2.偶氮偶联法:显示各种酶类最重要的方法
3.电子传递法:氧化酶和脱氢酶的显示 ;(一)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)
又称碱性磷酸单酯酶(EC3.1.3.1)
在碱性环境下催化多种醇和酚的磷酸酯水解
最适PH 9.2-9.4
激活剂: 如Mg++, Mn++, 某些氨基酸等
抑制剂: 氰化物、砷酸盐等
;(一)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)
分布:广泛存在于机体组织,常见于具??活跃转运功 能的细胞膜内,如毛细血管及毛细血管动脉部分的内皮细胞,肾近曲小管刷状缘和肠上皮纹状缘;
应用:1. 肝脏病、白血病的研究诊断;
2. 骨的发生和代谢疾病;;显示碱性磷酸酶的常用方法:
1. 钙钴法(Gomori-Takamatsu法)
【基本原理】
甘油磷酸钠 磷酸酯+Ca++ 磷酸钙 磷酸钴 硫化钴
【孵育液】
孵育液的成分:
3% β-甘油磷酸钠 10 ml
2% 巴比妥钠 10 ml
2% CaCl2 20 ml
5% MgSO4 1 ml
双蒸水 5 ml
;显示碱性磷酸酶的常用方法:
1. 钙钴法(Gomori-Takamatsu法)
【操作步骤】
1. 新鲜组织低温冰冻切片
2. 不固定切片直接进作用液, 或用1%氯化钙固定5 分钟-2小时, 4℃, 蒸馏水洗
3. 作用液10-60分钟, 37℃
4. 蒸馏水洗
5. 2%硝酸钴1分钟
6. 蒸馏水洗 ;显示碱性磷酸酶的常用方法:
1. 钙钴法(Gomori-Takamatsu法)
【操作步骤】
7. 1~2%硫化铵1分钟
8. 蒸馏水洗
9. 甘油明胶封片, 或脱水, 透明, 中性树胶封片
【结果】碱性磷酸酶活性处有黑色的硫化钴沉淀;肾曲管碱性磷酸酶---钙钴法 X100;肾曲管碱性磷酸酶---钙钴法 X200;2. 偶氮偶联法
⑴ Gomori萘酚磷酸酯法
AKP在碱性条件下将α-萘基磷酸钠水解出α-萘酚, 随后α-萘酚与固蓝B盐在酶活性部位偶联, 形成紫红至紫黑色的不溶性沉淀
【孵育液】 α-萘基磷酸钠, 蒸馏水, 5%四硼酸钠, 10%硫酸镁, 固蓝B盐
;2. 偶氮偶联法
⑵ 六偶氮对品红与α-萘酚偶联---以萘酚AS-BI磷酸酯或萘酚AS-TR磷酸酯与六偶氮对品红偶联
【孵育液】萘酚AS-BI磷酸钠, 二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO), Tris-cl或巴比妥醋酸缓冲液, 六偶氮对品红
【操作步骤】
1. 小块组织液氮骤冷, 低温冰箱切片
2. 甲醛钙液(Fca)固定5分钟, 4℃, 然后蒸馏水洗, 也可不固定;3. 作用液5-60分钟, 37℃或室温
4. 蒸馏水洗
5. 4%甲醛固定15分钟-2小时, 室温
6. 自来水洗,蒸馏水洗
7. 1%甲基绿5-10分钟, 蒸馏水洗
8. 甘油明胶封片, 或丙酮-丙酮甲苯-DPX封固
【结果】酶活性处出现红色无定形的沉淀,核呈蓝绿色
; 酸性磷酸酶(ACP)
1、反应原理(铅法):;AKP底物:
AKP常用的底物为α-萘酚AS-B1磷酸盐
偶联试剂:固兰BB~蓝色
固红TR~红色 ; (二)酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)
在酸性条件下催化醇和酚类磷酸酯的水解
最适PH为4.8-5.2
抑制剂因组织差异而不同: 酒石酸, 氟化物, 0.5%甲醛
分布: 主要位于溶酶体内
应用: 前列腺癌和其他脏器的转移性前列腺癌(+++)
Hodgins淋巴, 胃癌, 肺癌, 乳腺癌等(+++)
尤文氏瘤, 成骨肉瘤等(-);;;【操作步骤】
1. 新鲜组织低温冰箱切片
2. 不固定或吹干后丙酮固定15分钟
3. 用孵育液置于37℃水浴箱1~2小时
4. 流水洗,晾干(1-2分钟)
5. 用Mayer苏木精或1%甲基绿复染
6. 流水洗10分钟
7. 常规脱水透明, 中性树胶封片
【结果】酸性磷酸酶活性处呈桔红色,胞核兰色(苏木精复染)或绿色(甲基绿复染);涂片-腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶 X400;(三) 5′核苷酸酶
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