高通量测序标准操作规程.docx

PAGE PAGE 1 PAGE PAGE 2 高通量测序标准操作规程 标准操作规程 1：《模板制备标准操作规程》 2：《上机测序标准操作规程》 5.1 模板制备标准操作规程 1. 目的 制定 DNA 文库构建标准操作规程，使尽可能构建高质量的 DNA 文库。 2. 适用范围 实验过程中需要构建文库的 DNA 样品。 3. 责任 分子技术员应严格按照此规程操作。 4. 操作规程 4.1 准备工作（50min） 4.1.1 紫外杀菌：打开超净工作台内的紫外灯，杀菌 30min，关闭紫外灯，打 开风机，通风 10min。 4.1.2 打印相关材料：《测序记录单》。 4.1.3 实验前准备：通风结束后，根据《实验室安全防护规程》中的相关规定， 换好洁净服、洁净帽等进入实验室。 4.1.4 准备物品：根据一个批次 50个文库，准备 1.5ml 的 EP 管，双面板，1ml、 200μl、20μl、10μl 滤芯枪头，移液枪，磁力架，冰盒，Dnase free H2O (SIGEN)。 4.1.5 准备样品：从 S 检测人员处接收《Subit 荧光计 S 检测记录单》、《2100 生 物分析仪 S 检测记录单》，从-20℃冰箱的样品暂存处取出文库样品，核实文库 标号和文库条形码与检测记录单中是否匹配。核实通过后在装有文库样品的 EP 管盖上贴上标有 1-50 标号的圆形标签，在《测序记录单》上记录这批测序 样品的单号，并记录各标号所对应的样品 ID、文库条码及分配给该样品的 index 编号（LBA 的编号）。 4.1.6 计算文库稀释倍数：根据 2100 的分析结果，将文库片段“主峰处的摩尔 浓度”填到《样品稀释表》中，表格会自动计算出样品的稀释倍数，加样品的 体积，加水的体积。 4.2 稀释文库样品(30min) 4.2.1 文库样品完全溶解后涡旋混匀 15s，离心 2s，使溶液处于管底。 4.2.2 准备 10 个 1.5ml 的 EP 管，标号 1,2…..n 的编号，根据表中显示的加样品 体积和加水体积，先吸取相应体积的水到对应编号的 EP 管中，再吸取相应体 积的样品到对应编号的 EP 管中，涡旋混匀 15s，离心 2s。稀释后的样品在 48 小时之内使用。 4.2.3 取两个新的 EP 管，一个标号为 Mix，一个标号为 OT sample。分别从上 一步稀释好的 10 个样品中吸取 5μl 混合到 Mix 管中，涡旋混匀 15s，离心 2s。 吸取 60.5μl 的水于编号为 OT sample 的 EP 管中，再从 Mix 管中吸取 4.5μl 样品 于 OT sample 的 EP 管中，涡旋混匀 15s，离心 2s。 4.3 文库构建 一：片段化DNA并加接头 使用试剂耗材如下： 先后加入10ul TD Buffer，5ul DNA，5ul ATM至96孔板，使用枪头吸打几次混匀 贴上封膜，280g，20度离心1分钟 放入PCR仪： 55度 5分钟 保持在10度 一旦温度降到10度，马上进行下一步 每个孔加入5ul NT buffer，吸打混匀 封膜并离心 室温放置5分钟 二：PCR 使用试剂耗材如下： 加入15ul NPM 根据需要加入相应的5ul index 1引物（i7）及5ul index 2引物（i5） 吸打混匀，封膜，离心 放入PCR仪： 使用ampure磁珠纯化PCR产物 均一化文库并检测文库浓度及片段大小 5. 注意事项： 5.1 实验步骤较多，每一步实验开始前都要做好准备工作，每一步实验结束后 先清理前面的试剂耗材，再进行下一步操作。 5.2 配制反应液时确认好移液枪的量程和刻度，防止加错体积，试剂按照顺序 添加，防止漏加试剂。 5.3 实验过程中除使用仪器时在超净台外工作，其它一切工作都要在超净台中 操作； 6.紧急状况处理 实验过程中出现任何预期之外的情况，应及时上报给主管人员，并做好相关记 录，不可隐瞒不报。 5.2 上机测序标准操作规程 1. 目的 制定 DNA 文库构建标准操作规程，使尽可能构建高质量的 DNA 文库。 2. 适用范围 实验过程中需要构建文库的 DNA 样品。 3. 责任 分子技术员应严格按照此规程操作。 4. 操作规程 一：变性并稀释文库 将文库变性并稀释到合适上机浓度，根据需要混合不同上机文库 二：上机设置 将试剂盒取出并常温水浴解冻 将3ml 0.06% NaOCl加入试剂盒的28号孔 拿出Flowcell 室温放置30分钟 将3ml混合好的文库加入试剂盒中的样本孔 将Nextseq开机 主界面选择sequence 根据需要选择是否使用basespace，点next 放入Flowce