分子生物学考试资料.doc

第一二章遗传物质的分子本质 基因工程:分、切、接、转、筛 遗传物质的发现：肺炎双球菌的体内转化实验（格里菲斯） （a）将光滑型肺炎双球菌注入小鼠体内，使小鼠致死。（b）将粗糙型肺炎双球菌注入小鼠体内，对小鼠无害。（c）将光滑型肺炎双球菌加热杀死后，再注入小鼠体内，对小鼠无害。（d）将加热杀死的光滑型肺炎双球菌与粗糙型肺炎双球菌一起注入小鼠体内，小鼠死掉。 结论：加热杀死的S型细菌中，含有某种促成R型细菌转化为S型细菌的“转化因子” 肺炎双球菌的体外转化实验艾弗里及同事 取S型细菌，分离出其中的DNA，蛋白质，多糖以及将DNA与DNA酶混合，将以上四组分分别于R型细菌培养基混合培养；结果除有DNA组的培养液中既能分离出R型细菌又能分离出S型细菌，其余各组均只有R型细菌。 结论：只有DNA才是使R型细菌产生稳定遗传变化的物质。 DNA作为遗传物质的证实：噬菌体侵染细胞的实验 用放射性同位素35S标记蛋白质，32P标记DNA，，用标记的噬菌体感染细菌，发现只有标记的DNA进入细菌细胞内，而标记的蛋白质留在细胞外。 结论：DNA是遗传物质。 证明DNA的半保留复制 将大肠杆菌放在15N为唯一氮源的培养基上连续培养，使细胞内的DNA两条链上的14N被15N取代，收集菌体，一部分用于抽取DNA，一部分放在14N为氮源的培养基中继续培养一代，一部分提取DNA，另一部分继续培养，再提取DNA,用CsCl密度梯度离心的方法，发现0代为一条高密度带，两条链上的N原子全部是15N，第一代为中密度带，第二代中有中密度带和低密度两条带。 DNA的提取：1. 细胞裂解2. 去除蛋白等杂质（酚：氯仿：异戊醇25:24:1）3. 沉淀DNA（乙醇，异丙醇）4. 风干DNA5. 溶解DNA 细胞破碎：①机械方法：超声波处理法、研磨法（植物叶）匀浆法（动物组织）； ②化学试剂法：用SDS、CTAB（植物组织）； ③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。 DNA的测序：Sanger的双脱氧终止法 核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。 PCR技术（聚合酶链式反应） 原理：双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。 反应条件：Taq酶，dNTP,Mg离子，引物，模板 过程：变性，退火，延伸 核酸的分子杂交（Southern印记杂交） 原理：具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 步骤：（一）待测核酸样品的制备 裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段 （二）待测DNA样品的电泳分离 （三）凝胶中核酸的变性（碱变化）凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的 单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液 （四）Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程 （五）Southern杂交 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点预杂交液为不含DNA探针的杂交液2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA （六）杂交结果检测1、放射自显影2、比色或化学发光检测 第三章 基因、基因组及基因组学 基因：是DNA分子上具有特定功能的(或具有一定遗传效应的)核苷酸序列，是遗传的基本单位。（有编码序列和非编码序列两部分；后者包括调控序列、内含子及编码区两端的序列） 转座成分or 移动基因:是一些可以在染色体基因组上从一个位置转移到另一个位置，甚至在不同染色体之间跃迁的DNA成分。有人将之形象地称为跳跃基因。（Ac/Ds因子） Ac-Ds系统 玉米糊粉层颜色的控制涉及多对相关基因。C基因为野生型时，胚乳呈紫色，若C基因突变为c阻断了紫色素的合成，那么胚乳为白色。在胚乳发育过程中，若突变发生回复则导致产生斑点，回复突变发生得越早，产生的紫斑就越大，发生得越晚，则产生的紫斑就越小。McClintock认为突变基因c(无色)是由一个可移动的控制因子(controlling element)(现称转座子)引起的，称为解离因子(dissociator，Ds)，它能合成转