海水养殖源弧菌耐药性调查与致病性弧菌毒力基因检测-临床兽医学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 研究员 主席 教授 委员 研究员 委员 研究员 委员 研究员 委员 研究员 委员 秘书 答辩地点 答辩日期 上海海洋大学硕士学位论文 上海海洋大学硕士学位论文 海水养殖源弧菌耐药性调查与致病性弧菌毒力基因检测 摘 要 由于近些年，盲目的追求高产、超高密度的养殖、技术混乱、药物滥用、病 害流行、种苗质量差、环境污染等原因，对对虾的养殖带来很大的影响。为了探 究弧菌在对虾养殖过程中的流行病学、耐药性以及致病性，本研究针对本实验室 保存的上海、江苏、浙江、福建、海南等地海水养殖中发病对虾、鱼、蟹等的病 料分理出的弧菌对这些弧菌进行耐药性的检测，利用 PCR 的方法检测各个菌株 携带整合子的情况，对这些菌株进行耐药基因的检测，以及运用最小抑菌浓度法 MIC 来研究各个地区的弧菌耐药情况，针对耐药基因型和耐药表型对该菌做出 正确的判断，对耐药株地区的人工养殖进行临床指导，合理利用抗生素来预防细 菌性疾病，为临床指导提供了理论依据。在沿海 5 个省份采集到的患病动物和养 殖水体等，这些样品主要采自凡纳滨对虾和青蟹的血淋巴、肝胰腺、肌肉组织等； 和分离自鲈鱼、舌鳎、大菱鲆、河豚等的体表溃疡、肠道、腹水和血液样品。 1、耐药性分析 本文主要进行了 194 株弧菌对 8 种抗生素的 MIC 值和耐药基因的检测，研 究了分离菌株的耐药情况，对耐药表型和耐药基因型的相关性进行了比较，简单 的总结了弧菌在各地区的耐药情况。194 株菌的 MIC 值可以看出耐药率最高的 为红霉素和复方新诺明，分别为 60.8%和 58.2%；而对于链霉素，则处于中介范 围的菌株较多，有 156 株；耐药率最低的药物为氟苯尼考，仅有 7.7%。从不同 动物分离到的弧菌对 8 种抗菌药物的耐药率有所不同，从鱼类分离到的弧菌耐药 率相对较高，蟹类的最低且对氟苯尼考和土霉素耐药率均为 0。还对 194 株弧菌 检测了 1、2、3 类整合子和 4 类整合子所包含的整合酶基因。二类和三类整合酶 均未检测到，一类整合酶检出率高达 95.4%。194 株菌中，其中 11 株菌均含有一 类整合子的保守区，检出率为 5.67%，但 V-69、V-76、V-105 这三株菌不但具有 完整的整合子，而且还具有可变区基因盒。对可变区阳性 PCR 进行 T-A 克隆测 序后分别得到了 1308bp、1308bp 和 1315bp，这三株弧菌含有相同的基因盒，为 利福平 ADP-核糖基转移酶（Rifampin ADP-ribosylating transferase，arr-3）和二 氢叶酸还原酶（Dihydrofolate reductase，dfrA27）两种耐药基因盒，分别介导利 福平和甲氧苄啶耐药。 I 2、对虾源副溶血弧菌毒力基因检测 本章对试验室保存的 74 株对虾源副溶血弧菌进行毒力基因的检测和最近报 道的副溶血弧菌 pirA 和 pirB 基因检测，和弧菌的Ⅲ型分泌系统 T3SS1 和 T3SS2 检测；并对几株副溶血弧菌进行对虾感染试验，根据 24h 的半致死浓度 LC50， 判断副溶血弧菌的致病性。检测结果 tdh 和 trh 对基因均未检测到，而 tlh 的检出 61 株，检出率为 82.4%，T3SS1 的检出率较高，最高的毒力基因 VP1670 的检出 率最高为 62.2%；而 T3SS2 的检出率较低，最低的毒力基因 VPA1362 检出率为 0%。在副溶血弧菌中检测 pirA 和 pirB 毒力因子，检出率分别为 23.0%和 20.3%。 3、V-76 溶藻弧菌多重耐药和致病性 本研究从福建省福清采集的一尾凡纳滨病虾的肠道内容物中分离得到一株 溶藻弧菌，命名为：V-76。通过凡纳滨对虾回感实验和微量肉汤稀释法药敏实验 来分别研究该菌株的致病性和耐药性。此外，为了探究 V-76 的致病性和耐药性 的分子机制，本文还通过 PCR 方法对该菌进行了毒力基因、整合子相关基因和 耐药基因的检测。凡纳滨对虾回感实验结果表明，四组分别注射了 3.5×107cfu、 3.5×106cfu、3.5×105cfu 和 3.5×104cfu V-76 的对虾均发生了死亡，各组的死亡率 依次为 100%、100%、80%和 65%。除了 trh、toxR 和 UreR 之外，其它的毒力基 因均被检出，包括 tdh、tlh、toxS、Collagenase、FlaA、ompW、AspA 和 fur。药 敏实验结果显示，V-76 对多种抗菌药物表现出耐药，如氟苯尼考（32μg.mL-1）、 多西环素（32μ g.mL-1）、环丙沙星（>64μg.mL-1）、氯霉素（128μ g.mL-1）、链霉 素（