西兰花酶蛋白的联合测定法修改版西兰花酶蛋白的联合测定法修改版.doc

西兰花酶—蛋白联合测定法 包括： (1)可溶性蛋白(soluble protein)， (2)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)，SOD (3)过氧化物酶(peroxidase)，POD (4)丙二醛(malondialdehyde)，MDA (5)过氧化氢酶(catalase)，CAT 2 联合测定的原因： 节省人力，节省提取研磨过程 节省待测样品 3 联合测定的可行性： （1）汪俏梅，郭得平（2004）对POD、SOD、CAT进行联合测定。取1g西兰花样品，按1:5(W/V)加入0.05mol/L，pH7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆于4℃，13000g离心20min，上清液为酶提取液，分别测定POD、SOD、CAT活性。 （2）叶陈亮，柯玉琴，陈伟（1996），对可溶性蛋白、MDA、SOD、LOX进行联合测定。称1g花蕾，用含1%聚乙烯吡咯烷酮的50mmol/L，pH7.0磷酸缓冲液4ml与冰浴中研磨匀浆，15000r/m冷冻离心10min，上清液备用。 取上清液50μl，按Folin-酚法测定可溶性蛋白质含量； 取上清液1.25ml，加水1.25ml和0.5%硫代巴比妥酸三氯醋酸溶液2.5ml混匀，煮沸10min后离心比色测定，按陈贵推荐公式计算MDA含量； 取上清液10μl，按朱广廉法测定SOD活性，以SOD抑制NBT光化学还原50%所需酶量为一个酶活性单位； 取上清液0.5ml，按Surrey法比色测定LOX活性，以每分钟增加1个OD值为一个酶活单位。 4 联合测定的缺点 （1）时间比较紧张，要求合理安排顺序，相互之间溶液干扰； （2）最好是同时做，人员比较多； （3）仪器，尤其是分光光度计要求要足够，不要相互之间抢； （4）需要标准曲线的最好一起做，它要求所有待测样尽量在同一条件下测定。其它酶也是么？解决，减少实验次数，集中在1-2次内完成。做大量的预备实验，熟练技能。达到实验组每个成员倒背如流。 方案 想最后都一起测，理由是我们认为可以保证较低温度和酶活性不失活，并且我们保证人员充足，速度达到或接近单个指标的测定。如果大批量同时测的话，分光光度计最多可以得到3台/4台。 复合物的提取（主要是酶） （一）冰浴研磨法 取样，1.0g西兰花花蕾样品 放入事先预冷的研钵，先加入2ml的提取液（先预冷），加入少量石英砂，冰浴研磨至匀浆 再加入3ml提取液继续研磨 转移至10ml离心管，用2ml提取液冲洗研钵，混匀 冰浴抽提30min，不时的轻摇 离心，4℃，13000g，15min 将上清转移至带刻度的试管，记录每一试管的体积 将酶液保存在冰浴中，严格保护，备用 注（1）提取液总体积为7ml，即选用7倍体积的提取液 （2）提取缓冲液成分： 50mM磷酸缓冲液pH7.5 内含（1）PVP 1% （2）EDTA 2mM，pH8.0 （3）β-巯基乙醇 0.04% （二）液氮研磨法 取样，1.0g西兰花花蕾样品 放入事先预冷的研钵，加入液氮，并加入少量石英砂，研磨至粉末，用预冷的药匙将粉末转移至10ml离心管，加入7ml提取液，冰浴保护30min，不时摇匀 离心，3900rpm，20min，尽量保持在低温 将上清液转移至10ml量筒，记录体积，转移至10ml离心管，低温保护备用 第一部分 可溶性蛋白含量的测定 ——考马斯亮蓝（G-250）法 原理 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大吸收在488nm，当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其吸光值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间达到平衡，完成反应非常迅速；其结合物在室温下1小时内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便、快捷，反应非常灵敏。灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级的蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0~1000μg/ml，是一种非常常用的微量蛋白快速测定方法。 试剂配制 1 牛血清白蛋白标准溶液的配制： 准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸馏水中，即为1000μg/ml的原液（4℃保存）。 蛋白染色剂—考马斯亮蓝G-250的配制： 称取100mgG-250，溶于50ml90%乙醇中，加入100ml85%（w/v）的磷酸，最后定容至1000ml。此溶液在常温下可保存1个月。 注意： （1）乙醇可用无水乙醇配，无水乙醇与95%乙醇价格差0.5元左右； （2）磷酸本身浓度为85%。 标准曲线的制作 1 标准曲线的制作 （1）0~100μg/ml标