小鼠骨髓多染红细胞微核试验氟化钠-培训课件.pptVIP

小鼠骨髓多染红细胞微核试验 受试物：氟化钠 北京大学公共卫生学院 毒理学课程小组学习 微核实验 常用的致突变试验，细胞遗传损伤的指标之一，可用于染色体断裂剂和纺锤体损伤剂的检测 化学致突变物 无着丝点断片 整个染色体 带着丝粒的环和断片 原理： 1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中 断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向移动，从而遗留在细胞质中 小鼠骨髓多染红细胞微核实验中 微核可出现于多种细胞中，但在有核细胞中难以与正常核的分叶及核突出物区分，故常计数PCE细胞中的微核，因为成红细胞发展为红细胞时，主核排出，成为PCE，这些细胞保持其嗜碱性约24小时，然后成为NCE,并进入外周血。 在主核排出时，已形成的微核可留在胞浆中。因此，这些在细胞中没有主核，便于观察。观察并计数多染红细胞中的微核，可反映染色体断裂和纺锤体损伤情况。本试验的测试终点为染色体损伤。 PCE：polychromatic erythrocyte,多染红细胞 NCE：normochromatic erythrocyte,正染红细胞 试剂与器材 （一）实验动物：成年小鼠 （二）试剂： 受试物：氟化钠 阳性对照物：环磷酰胺、丝裂霉素C、三亚乙基密胺、甲磺酸乙酯、乙基亚硝基脲… 小牛血清（使用前pH调至6.4） 甲醇 磷酸缓冲液 Giemsa（吉姆萨）染液：用时，将Giemsa原液用pH6.4的磷酸缓冲液1:10稀释 （三）器材：（略） 实验设计 实验动物：ICR小鼠，体重18-22克，每组10只，雌雄各半，随机分组 剂量分组： 原则： 最高剂量可选用动物的最大耐受剂量或化合物LD50的50% 不能引起明显的骨髓抑制，即PCE/(PCE+NCE)不低于对照值的20% （因为骨髓发生抑制时，外周血会发生反流） 氟化钠：LD50=224.9mg/kg 阴性对照组 水 受试物剂量组 高剂量组 224.9*50%=112.5mg/kg 中剂量组 112.5*1/2=56.25mg/kg 或*1/4=28mg/kg 低剂量组 56.25*1/2=28.125mg/kg 或*1/4=7mg/kg 阳性对照组 环磷酰胺 120mg/kg 1/2 1/4 1/8 11.25mg/ml 5.625mg/ml 2.8125mg/ml 0.1ml/10g NaF:90mg 8ml 11.25mg/ml 4ml 4+4ml 5.625mg/ml 4ml 4+4ml 2.8125mg/ml 三. 染毒途径：灌胃 四. 染毒次数及骨髓采样时间 一次染毒、间隔24小时两次染毒、多次染毒 应于最大敏感期取样（预实验） 本次实习采用一次染毒，24小时后取样测定 操作步骤 24小时后 制片 染色 镜检 染毒 取材 取骨 擦净血污、剔去肌肉 剪去骨骺端 小牛血清 混匀、推片 吹干 甲醇中固定2min Giemsa染色液染色10-15min pH=6.4 pH=6.4 冲洗、晾干 镜检、细胞计数 镜检 先在低倍镜下观察染色及细胞分散情况，再以油镜计数 每例样本计数1000个PCE，记录有微核细胞数，一个细胞中有几个微核时，记为一个有微核细胞。 再计数200个红细胞，记录PCE在总红细胞（PCE+NCE）中的比例，作为对细胞毒性的指标 多染红细胞 PCE 正染红细胞 NCE 微粒 浅兰色 胞浆呈颗粒状 油画 淡红色 胞浆呈均质状 水彩画 圆形或椭圆形 边缘光滑 染色与有核细胞的核一致，紫红色 大小约为红细胞的1/20-1/5 MN MN NCE 图 1 ：正常嗜多染红细胞 PCE （× 400 ） 图 2 带微核嗜多染红细胞 MNPCE （× 400） 结果分析与评价 受试物 剂量（mg/kg） 各受试小鼠1000个受检细胞中含微核细胞数 总计 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NaF 112.5 56.25 28.125 水 0.1ml/10g 环磷酰胺 120 受试物 剂量（mg/kg) 受检细胞总数（个） 含微核细胞数（个） 平均微核千分率（‰） 标准误 NaF 112.5 1000 56.25 1000 28.125 1000 水 0.1ml/10g 1000 环磷酰胺 120 1000 结果分析与评价 受试物 剂量（mg/kg） 各受试小鼠200个红细胞中含PCE数量 总PCE 总PCE/2000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NaF 112.5 56.25 28.125 水 0.1ml/10g 环磷酰胺 120 结果分析与评价 用统