RNA干扰技术概念.ppt

RNAi的应用 MicroRNA (miRNA): A New Class of Small RNA Molecules siRNA—小干扰RNA stRNA 小时序RNA miRNA microRNA It appears that “ tiny RNA world” may not be so tiny after all The DNA vector-based RNA interference (RNAi) technology BD? Knockout Adenoviral RNAi Systems T T T T T U6 Pro Sense Anti Sense Spacer Kan R pUC ori User defined sequence for RNAi pSIREN-Shuttle I-Ceu I PI-SceI BD? Knockout Adenoviral RNAi Systems 系统能快速、方便的形成表达发夹结构的siRNA的重组腺病毒，从而有效的侵染到各种宿主细胞。 BD Knockout Adenoviral RNAi System 1使用RNAi-ready pSIREN Shuttle vector，通过酶切连接构建腺病毒DNA质粒。可感染分裂及非分裂细胞，宿主细胞范围广，可实现高水平表达。能感染难以转染的细胞。 siRNA表达载体 pSIREN 载体分为两种：pSIREN-Shuttle和pSIREN-RetroQ。pSIREN 载体带有U6启动子，均为线性载体，pSIREN-RetroQ载体带有真核筛选标记嘌呤霉素抗性基因 pSIREN-Shuttle可以进一步应用于构建腺病毒载体； pSIREN-RetroQ可以进一步应用于构建逆转录病毒载体，应用于感染难以转染的细胞。 BD Knockout RNAi vectors Luciferase b-actin 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 pSIREN-Shuttle pSIREN-DNR pSIREN-Retro Q 1: CMV-Luc only 2: + aLuc shRNA 3: + Neg control pSIREN vectors: Dual Plasmid- and Viral-based shRNA Vectors n=3 siRNA表达框架(siRNA expresion casetes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模板，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。 siRNA表达框进行体内转录 表达框架包括： 一个RNA pol III启动子 一段发夹结构siRNA 一个RNA pol III终止位点 优点：SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到。SECs成为筛选siRNA最有效工具。 缺点：PCR产物难以转染入细胞、不适合大规模制备。 总结5种不同的制备siRNA的方法。 *取决于合成后是否包含纯化、去保护，以及厂家提供的是已经退火的即用型双链还是冻干的单链 中等 中等 低 中等 高 每个基因的相对费用（不包含人力） 不可以 可以 不可以 不可以 不可以 检测总体转染效率 有限 可以 有限 有限 可以 能否大规模制备 不可以 可以（抗生素筛选） 不可以 不可以 不可以 能否用于长效抑制 不可以 可以 不可以 不可以 ?不可以 可筛选性 (例如抗生素筛选) 差 差 好 好 好 转染的相对难易程度 不能 不能 能 能 能 能否标记siRNA (例如用于荧光显微镜分析siRNA进入细胞过程或者在细胞中的定位） 需要 需要 不需要 需要 需要 是否需要验证和寻找最有效siRNA 中等 多 中等 中等 几乎不需要* 个人所需操作时间 ~ 6 小时 + DNA oligo合成时间 5天以上 + DNA oligo合成时间 1 天 + 转录模版制备时间 24 小时 + DNA oligo合成时间 4天—2周 全部制备/合成时间所需时间 ?~50-mer DNA oligos(一对) 55-60-mer DNA oligos(一对) 转录模版 (200-1000bp，两侧带T7 启动子) 29-mer DNA oligos(一对) ?21-mer RNAoligos(一对) 材料需求 PCR表达框 siRNA表达载体 RNase III降解dsRNA 体外转录 化学合成 ?比较项目 Nitrite amount iNOS SiRNA