细菌表达2.docVIP

细菌表达蛋白 将表达质粒转化进BL21，挑单克隆小摇8~12h，换大摇（1L LB，Amp工作浓度100 μg/ml，存储浓度100mg/ml），37℃摇床培养至OD600到 0.4-1(最佳OD600为0.5~0.6)，加入IPTG 至终浓度0.5mM，20℃ 诱导过夜，细菌生长进入平台期（OD600为4.0~20）后收菌。 10000g，离心10mins收集菌体，弃上清，尽量去除培养基，用100ml裂解缓冲液重悬菌体（1ml裂解液：10ml菌液）。 冰上放置1h，隔15mins震荡一次。 超声：5s×5s，6次，强度50%。冰上操作，避免加热和起泡。 裂解液10000g 离心15mins，分离上清和沉淀，将上清转移到新管，20000g离心15min，分离上清与沉淀。 中间平衡树脂:取500ul新鲜树脂或相应量再生树脂到柱中，1000ul MilliQ洗2次;1000ul 1×Charge buffer洗3次，每次孵育10mins;1000ul 1×binding buffer洗2次。 将5上清与resin翻转结合4h。 1000ul wash buffer(自配30mM咪唑) 洗10次,每次孵育30s~1min后，揭开底盖让液体流出; 500ul Elute buffer洗脱,孵育10min，收集洗脱液; 500ul strip buffer洗2次,保存在此缓冲液中，树脂可以重复使用。 超滤去除咪唑：转移洗脱液500ul到0.5ml超滤管（10?kDa）中，4℃ 14000 g离心20min后，加入预冷的1×PBS 500ul，4℃ 14000 g离心25min。将超滤管中溶液1000 g离心2mins到新管后，加入预冷的1×PBS 500ul。 预清洗beads：取Glutathione Sepharose 4B beads 悬液133ul，即100ul beads，到1.5ml EP管中，加入1000ul冷PBS，500g离心分钟，反复洗次g离心洗次将2.38 g IPTG溶于100 ml 去离子水。过滤除菌并储存于–20°CLysis buffer Reagent Final concentration Quantity Tris-base（FW121.1） 20mM 242.28mg NaCl（FW58.5） 500mM 2.92g imidazole（1M） 5mM 500ul Glycerol 5% 5ml Triton X-100 1% 1ml HCl Adjust to pH7.9 Milli-Q water Maker up to 100ml Protease inhibitor Storage concentration Final concentration Quantity Lysozyme 1mg/ml 50mg PMSF(FW 174.19) 1mM 8.7mg Aprotinin 5ug/ul 2ug/ml 20ul Pepstain 1.76ug/ul 1ug/ml 28.4ul Lysis buffer Maker up to 50ml His wash buffer Reagent Final concentration Quantity Tris-base（FW121.1） 20mM 121.1mg NaCl（FW58.5） 500mM 1.46g Imidazole(1M) 30mM 1.5ml HCl Adjust to pH7.9 Milli-Q water Maker up to 50ml GST Elusion buffer 分装存储于-20℃，避免反复冻融超过5次 Reagent Final Concentration Tris-HCl（pH 8.0） 50 mM Triton X-100 0.1% reduced glutathione 60 mM