土壤酶活性测定方法.doc

土壤酶活性测定方法 一、蔗糖酶: 3，5-二硝基水杨酸比色法 1. 试剂配制 2N氢氧化钠200mL：称取16g 氢氧化钠，用蒸馏水溶解，定溶于200mL容量瓶中。 3，5-二硝基水杨酸溶液 1000mL：称5g二硝基水杨酸，溶于200mL2N氢氧化钠和500mL蒸馏水中，再加300g酒石酸钾钠，用蒸馏水稀释至1000mL（不超过7天）。 1/15M 磷酸氢二钠1000mL：23.867g Na2HPO4·12H2O溶于1000mL蒸馏水中。 1/15M 磷酸二氢钾 1000mL：9.078g KH2PO4溶于1000mL蒸馏水中。 pH5.5磷酸缓冲液100mL：5 mL磷酸氢二钠(1/15M)加95mL磷酸二氢钾(1/15M) 8%蔗糖1000mL：称取80g蔗糖，用水溶解，稀释至1000mL。 甲苯。 标准葡萄糖溶液（1mg/mL）1000mL： 取少量葡萄糖在真空干燥箱中，于55℃条件下真空干燥至恒重。然后取1.00g葡萄糖溶于100ml蒸馏水中成标准葡萄糖母液（10mg还原糖/ml）。取此母液10ml, 用蒸馏水定容至100mL即成标准葡萄糖液（1mg/ml）； 2. 操作步骤 （1）标准曲线绘制：分别取标准葡萄糖液 0.4mL，0.8 mL，1.2mL, 1.6mL, 2.0mL,2.8mL, 3.2mL于50 mL比色管中，另取一管做空白对照。用蒸馏水补足至10mL。加入3.0mL 3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5min，随即在自来水流下冷却。最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。 比色后，以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。 （2）土壤蔗糖酶活性测定：称5.00g土样，置于50mL三角瓶中，注入15.0mL 8%蔗糖溶液，5.0mL pH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，6000rpm离心10min。取1.0mL上清液（新鲜土样所吸取的上清液体积为1.0mL；风干土及保存1个月的土样所吸取的上清液体积为0.5mL）于50mL比色管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。 为消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差。每一土样需做无基质对照。整个实验需作无土壤对照。 3．结果计算 蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。 葡萄糖（mg）=(a-b)×c 式中 a---从标准曲线查得的样品（加了基质）对应的葡萄糖浓度，mg/mL； b---从标准曲线查得的样品对照组的葡萄糖浓度，mg/mL； c---换算成1g土的系数。 二、脲酶: 靛酚比色法 1. 试剂配制 pH6.7柠檬酸盐缓冲液1L：取184g柠檬酸溶于300mL蒸馏水中，另取147.5g KOH溶于水，再将两种溶液合并，用1N NaOH将pH调至6.7，并用水稀至1L。 苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，然后用乙醇稀释至100mL(A液)，保存在冰箱中。称取27g NaOH溶于100mL水中（B液），保存在冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混合，并用蒸馏水稀释至100mL备用。 次氯酸钠溶液100mL：取10%的次氯酸钠溶液9mL，用水稀释定容于100mL容量瓶中，即活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 10%尿素溶液500mL：取50g尿素，用水稀释至500mL。 甲苯。 氮的标准溶液1L：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1L，则得含氮0.1mg/mL的标准液。再稀释10倍得到N工作液。 2. 操作步骤 （1）标准曲线绘制：分别取氮的工作液1、3、5、7、9、11、13mL于50 mL比色管中，另取一管做空白对照。用蒸馏水加至20mL。再加4.0mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于波长578nm处进行比色。根据光密度值与溶液浓度绘制标准曲线。 （2）土壤脲酶活性测定：称5.00g土样，置于50mL三角瓶中，加入1.0mL 甲苯。15min后加10mL10%尿素液和20mLpH6.7柠檬酸盐缓冲液。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。到时取出，6000rpm离心10min。取3.0mL上清液（新鲜土样所吸取的上清液体积为2.0mL；风干土及保存1个月的土样所吸取的上清液体积为0.5mL）于50mL刻度试管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。 3. 结果计算 脲酶活性以24h后1g土壤中NH3—N的毫克数表示。 NH3—N（mg）= a×b 式中 a---从标准曲线查得的NH3—N浓度，mg/mL； b---换算成1g土的系数。 三、蛋白酶：茚三酮比色法 1. 试剂配制