厚壳贻贝血细胞及血清抗菌肽的分析.pdfVIP

中国摩亏通攉 。 : ?厚壳贻贝血细胞及血清抗茵肽的分析 杨丽佳,武 梅,王信超,李楠楠,杨 林,陈铭杰,廖 智 浙江海洋学院海洋科学学院/海洋生物资源及分子工程实验室,浙江舟山 摘 要:厚壳贻贝 是中国东部海域广泛分布的具有重大经济价值的水产养殖贝类,其 血淋巴中含有多种抗菌肽分子。为了解厚壳贻贝血细胞和血清抗茵肽分子的组成特点,采用多维高效 液相色谱对厚壳贻贝血清及血细胞的抗菌肽进行分离纯化,从中鉴定了多种具有抗菌活性的抗茵肽分 子,质谱鉴定结合文库数据分析表明厚壳贻贝血细胞和血清的抗菌肽主要属于 和 抗茵肽家族,分子量在 ~之间,血细胞和血清抗菌肽在分子组成、抗菌谱方面均存在差异, 此外还发现有分子量在左右的新型抗茵肽分子。以上工作为深入了解厚壳贻贝 抗菌 肽的分子多样性、了解厚壳贻贝的免疫机制以及从中筛选具有开发价值的抗菌肽分子奠定了基础。 关键词:厚壳贻贝;抗茵肽;血细胞;血清;质谱 中图分类号:文献标志码: 论文编号:. , , ,, , ,, , : .. , , . . . . , . , ,.: ; ; ; ; 基金项目:浙江省科技厅面上科研农业项目“贻贝抗菌功能多肽的提取与应用研究” ;农业部海洋与河口渔业资源及生态重点开放实 验室开放课题“厚壳贻贝抗菌肽的结构与功能研究” 开一 ? ; 年浙江省大学生科技创新活动 新苗人才计划 项目“厚壳贻贝抗菌肽的分子多 样性分析”。 第一作者简介:杨丽佳,女,年出生,浙江海盐人,学士,研究方向:海洋生物活性物质。通信地址: 浙江省舟山市定海区文化路号浙 江海洋学院海洋科学学院, : ?, ? : .。 通讯作者:廖智,男,年出生,湖南长沙人,副教授,博士,研究方向:蛋白质及多肽结构与功能,发表论文 多篇。通信地址: 浙江省舟山 市定海区文化路号浙江海洋学院海洋科学学院, :., ? :.. 。 收稿日期:? ? ,修回日期: ? ? 。杨丽佳等:厚壳贻贝血细胞及血清抗菌肽的分析 再次离心收集,在光学显微镜下进行检测,以确定是厚 引言 壳贻贝的血细胞之后,参照文献方法 】,采取超声法破 抗菌肽是广泛分布于生物体内的一类多肽分子, 分子量通常分布于 ~左右,由 个氨 裂细胞,再经手持式组织匀浆器匀浆,匀浆液经离心 基酸残基组成。低等生物由于缺乏特异性免疫系℃, × , 后收集上清,于一 ℃冰箱保 统,因而抗菌肽对于低等生物的免疫系统具有特别重 存备用。 . . 厚壳贻贝血淋巴抗菌肽的分离纯化 采用高效液 要的意义,同时,抗菌肽也因其高效的抗菌活性而备受 研究者关注 。贻贝抗菌肽是海洋生物抗菌肽研究中 相色谱对厚壳贻贝血淋巴抗菌肽进行分离纯化,所有 的重要内容,目前已从贻贝血细胞和血清中分离鉴定 分离步骤均在型高效液相色谱仪 美国 公司 上完成,检测器为型紫外检 了 种抗菌肽家族,分别为, ,和 ,主 要 分 离 白地 中海贻 贝 测器 美国公司 ,检测波长为 和 和紫贻贝。厚壳贻 双波长检测。 贝是广泛分布于中国东部沿海的一种具有重要经济价 第一步:反相色谱柱为半制备型反相色谱柱, ×,公司 ,分别以含 值的贝类,对于其血淋巴中的抗菌肽研究目前尚不多 见,在前期工作中,作者通过构建厚壳贻贝血细胞的 .%的 %乙腈、 %乙腈和 %乙腈洗脱,流速 文库,从中克隆了和 抗菌肽的基 为 / ,柱温为,分别收集洗脱组分,经冷冻 因家族 圳。此外,作者还从厚壳贻贝血清中分离鉴定 干燥后分别进行抑菌活性检测;第二步:在上述步骤中 了 种抗菌肽的同分异构体 。为深入了解厚 获得的具有抗菌活性的组分分别上样反相高效液相色 壳贻贝血细胞和血清中抗菌肽分子的组成特点以及组 谱,色谱柱为分析型 反相色谱住 , 成差异,作者采取高效液相色谱以及质谱分析方法,结 .×, 公司 ,流动相分别为含 . % 合厚壳贻贝血细胞的 文库数据分别对厚壳贻贝 的水 和乙腈 ,流速为/ ,柱温为 血细胞和血清的抗菌肽分子组成、抗菌活性等进行了;洗脱梯度分别为 内 液浓度由 %到 研究。% 血清样品 以及 内 液浓度由 %到 % 材料与方法 血细胞样品 。根据洗脱峰出峰顺序分别收集各洗脱 . 动物与试剂 组分,经冷冻干燥后进行抑菌活性测试。 .. 试验动物 成年厚壳贻贝采自 . 抗菌活性检测 参照文献方法 测定各洗脱组 浙江舟山东极岛海域,以洁净海水在通氧条件下饲养 分的抗菌活性。细菌用液体培养基培养至 于恒温水族箱~ ℃ 。 对数生长期,然后用相应培养基稀释至光密度值 .. 试剂 三氟乙酸 、 一氰基一 一羟基一肉桂酸,。 为 .;在预先经灭菌处理的 孔板中每个 来自于 公司:所有测序试剂均来自 孔加入 菌