3-基因工程原理ds-测序技术.ppt

基因工程原理;;造福人类的HGP;第一节DNA测序策略;一、序列确实证性测序策略;一、序列确实证性测序策略;〔一〕随机测序法;〔二〕定向测序法;〔二〕定向测序法;〔二〕定向测序法;〔二〕定向测序法;〔二〕定向测序法;KeyGenomicsTechnologies;;第二节传统的DNA序列分析法;1970年创造了第一种DNA测序方法;Sanger双脱氧链终止法;一、根本原理;双脱氧链终止法的测序根底是以双脱氧核苷三磷酸为测序反响的链终止剂。;*;P;;*;双脱氧链末端终止法测序原理示意图;二、测序反响体系的组成;Sanger双脱氧-M13体系;*;*;*;*;二、测序反响体系的组成;二、测序反响体系的组成;二、测序反响体系的组成;二、测序反响体系的组成;三、Sanger双脱氧链终止法的特点;Maxam-GilbertDNA化学修饰法;由于这种化学切割反响的特异性是由碱基的修饰作用决定的，所以切割反响必定是定量的

化学切割反响的试剂：

肼hydrazine

联氨NH2-NH2

硫酸二甲酯dimethylsulphate

六氢吡啶;碱性条件下，肼与胸腺嘧啶〔T〕和胞嘧啶〔C〕作用

通过六氢吡啶作用，使两个磷酸分子从糖片段上释放出来，导致在核苷酸位置上发生DNA的断裂

盐存在的条件下，肼同T的反响被抑制，只发生胞嘧啶碱基特异的切割反响

由此区别C和C+T两种反响;硫酸二甲酯〔(CH3O)2SO4〕

一种碱性的化学试剂

作用于DNA碱基环中的氮原子，使之甲基化

在中性的pH值环境中，可导致配糖键发生水解，使去碱基的糖-磷酸键十分微弱

碱性条件下磷酸分子从DNA链上脱落，造成链的断裂

鸟嘌呤〔G〕的N7腺嘌呤(A)的N3

六氢吡啶作用，从脱氧核糖上移去2个磷酸分子，使DNA链在甲基化的鸟嘌呤G位点断裂;*;CS载体系统：末端标记载体

核酸内切酶Th111Ⅰ

特点：

产生5’单碱基的突出末端，便于标记；

Th111Ⅰ位点十分稀少；

5’突出末端可以是G或A，也可以是T或C，选择性强；

在载体中具有两个Th111Ⅰ位点，可对克隆在载体上的片段任何一段作选择性标记;化学修饰法的优点：

不需要体外酶切；

只要有末端标记，无论单双链都可用来测序。

限制因素：测序胶的分辨率;DNA杂交测序;*;两种操作方式：

1.将不同的寡核苷酸与固定在滤膜上的靶DNA序列样品进行杂交

2.应用寡核苷酸矩阵芯片的DNA杂交测序法;杂交测序的应用;毛细管电泳;;;〔三〕阵列毛细管电泳CAE，Capillaryarrayelectrophoresis

将毛细管电泳与板凝胶电泳的优势相结合，采用毛细管凝胶电泳的装置，将多支毛细管并列进行别离与检测，以板凝胶电泳的优势弥补了毛细管凝胶电泳的缺乏，可一次检测多个样品；

阵列毛细管电泳散热效率高，适于高电场强度电泳，是一种高速、高通量的测序法；

使用非凝胶基质，毛细管壁可以抑制横向扩散，具有易于实现自动化的优点。;DNA序列分析的自动化;;测序仪原理;2.循环测序;377型遗传分析仪;;NextGenerationSequencing;表目前使用最广泛的三大第二代测序平台测序能力统计信息〔2021年年初数据〕;Roche454焦磷酸测序;原理;*;测序原理;测序原理;工作流程;工作流程;工作流程;工作流程;454sequencing：EmulsionPCR(emPCR);454sequencing：DepositionofDNAbeadsinto thePicoTiter?Plate;454测序系统图示;测序质量;图a为高通量鸟枪Sanger测序法策略

图b为鸟枪循环芯片测序法策略

;;;2007年6月，JamesWatson的基因组序列登录到了GenBank数据库当中，这是第一次使用非Sanger测序法获得了人类个体基因组序列，且第一次将个人基因组序列公之于众

整个测序在两个月之内完成，花费不到100万美元，仅占耗时10年之久的人类基因组方案使用经费的千分之一，Venter基因组方案费用的百分之一;;IlluminaSolexa合成测序;ClonalSingleMoleculeArrays

单分子克隆;ReversibleTerminatorChemistry

可逆终止反响;Sequencing-by-Synthesis(SBS);Basecallingfromtherawdata;Solexa测序Workflow;;;;;;思考题;*