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RNA反转录原理及应用
2016年11月吴思思2021/5/91
原理酶过程意义本实验所用的技术12345页码RNA反转录6注意事项2021/5/92
RNA反转录原理反转录是以RNA为模板,通过反转录酶(Reversetranscripatase),合成DNA的过程,是DNA生物合成的一种特殊方式。问题1:反转录酶是指代哪些?是特定的一个还是多个酶共同作用?答:反转录酶有两种,一种是来源于哺乳动物,另一种来源于鸟类。哺乳类的反转录酶都是一条多肽链;鸟类的反转录酶则由两上亚基结构。所以反转录酶是特定的一个酶,但是它具有多种活性,在反转录不同阶段中发挥不同的作用。2021/5/93
RNA反转录原理[注]:反转录与逆转录不等同。反转录是进行基因工程过程中,人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA,并以之为模板人工合成DNA的过程;逆转录是RNA类病毒自主行为,在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程。二者虽同为RNA→DNA的过程,但地点不同,相对性的来说,反转录在体外,逆转录在体内。2021/5/94
RNA反转录过程2021/5/95
反转录酶(RDDP)的活性反转录酶以RNA为模板,催化dNTP聚合成cDNA反转录酶RNaseH从RNA5′端水解掉RNA分子RNaseH活性以反转录合成的第一条cDNA单链为模板,再合成第二条cDNA分子DNA指导的DNA聚合酶活性问题2:反转录酶能不能现在进行生物体外技术合成?答:反转录酶是生物中提取的。还不能自主合成。2021/5/96
反转录的生物学意义(1)对分子生物学的中心法则进行了修正和补充(2)在致癌病毒的研究中发现了癌基因,在人类一些癌细胞如膀胱癌、小细胞肺癌等细胞中,也分离出与病毒癌基因相同的碱基序列,称为细胞癌基因或原癌基因。癌基因的发现为肿瘤发病机理的研究提供了很有前途的线索。(3)在实际工作中有助于基因工程的实施。由于目的基因的转录产物易于制备,可将mRNA反向转录形成cDNA用以获得目的基因。2021/5/97
技术应用——RT-PCRRT-PCR又称反转录PCR。是将RNA的逆转录(RT)和聚合酶链式扩增反应(PCR)相结合的技术。其原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的RNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物在逆转录酶的作用下反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得大量的cDNA。问题3:cDNA与DNA的区别答:cDNA就是由成熟mRNA经过反转录过程而成反转录的DNA,与正常DNA相比区别是内部无内含子等结构。2021/5/98
技术应用——RT-PCR问题4:为什么选dT引物?答:真核生物的mRNA都有个PolyA的尾端,dT引物能识别这个尾端并且结合上去。2021/5/99
技术应用——RT-PCR引物?随机六聚体引物:对总RNA进行反转录?Oligo(dT):对mRNA进行反转录?2021/5/910
操作——RT-PCR以本实验下丘脑c-fosmRNA表达测定为列。在微量EP管中加入以下反应溶液:步骤1dT引物dNTP混合物处理过RNA酶的水2021/5/911
操作——RT-PCR以本实验下丘脑c-fosmRNA表达测定为列。反应结束后在冰上急速冷却,并加入以下试剂:步骤2得到cDNA引物RNA酶抑制剂反转录酶处理过RNA酶的水2021/5/912
技术应用——RT-PCRPCR仪1、按PCR仪正面左下角电源开关,启动PCR仪。2、放PCR离心管。3、反向重复第二步骤将顶盖板向后拉,盖好顶盖。4、按F2“Create”新建一个扩增的PCR程序。5、按控制台面右方上下左右方向键,可随意移动编辑位置,输入需要的温度、时间、循环数等。6、据PCR离心管中加入的反应体积总量,在“Reactionvolume”后输入相应数值,有Std“1~100ul”和9600“1~50ul”两档可供选择。7、按F1“Start”启动8、按“INFO”对应键查看PCR结束键。9、扩增完成后按台面左方“Stop”键退出。10、按“Hist”,可查看上次扩增的历史记录。11、完全退出后,按台面左下方电源开关,拔出插销,切断电源。2021/5/913
技术应用——RT-PCR1.在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂。2.防止DNA的污染
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