短路电流技术介绍.ppt

短路电流技术介绍内容简介短路电流的原理研究的对象上皮细胞短路电流装置短路电流的实验方法常见的离子通道短路电流的原理上皮细胞生物体内依靠不同组织系统的作用有选择性的将必须的非电解质和电解质从外环境吸收或者从内环境分泌出去，所有这些组织系统由大量形态较规则，排列紧密的细胞组成，这些多面体细胞组成的几乎没有细胞间质的薄层称之为上皮。具有极性：顶膜面和基底膜面特点具有紧密连接，在形态上彼此紧密的相连续不具有毛细血管，依赖附近的结缔组织供给营养和氧气主要功能：屏障功能和有方向性物质转运功能。消化道中的Cl-分泌上皮组织的来源用短路测量的上皮组织需要在细胞间形成紧密联接，防止离子渗露，影响测量结果，这就需要我们上在短路上的组织是满满的一层细胞。这种满单层细胞有两种来源：１.急性离体的单层上皮细胞如大鼠胃和结肠的上皮：急性处死大鼠后，用剪刀和镊子取出组织，在电镜下小心去除非上皮部分，留下的完整单层上皮固定到小室（chamber）上进行短路电流测量。２.人工培养的单层上皮细胞将购买回来的细胞株或原代培养的细胞经过一定的培养和传代后，用酶消化下来种在做好的通透性支撑膜上，然后将其放在盛有培养基的无菌培养皿上培养一定天数（期间要定时换液），即可上短路电流实验。短路电流装置短路电流装置短路电流(ISC)定义为穿过上皮并使得跨上皮电压降为零的电流。钳制模式1.电流钳模式－跨上皮电流被钳制在0μA，测量细胞两侧的电势差。2.电压钳模式－组织的跨上皮电压被设定在一个特定的值，然后接通电压钳，跨上皮电流将此电压维持在预设值上。这种模式用于测定由上皮主动转运的离子。短路电流的测量短路电流图形中，正向电流的增加表示电流方向从I2向I1流动，根据物理学上定义，此时阳离子从I2侧向I1侧移动，或阴离子从I1侧向I2侧移动，或是两者相互作用的结果，如下图。短路电流的实验方法研究上皮正常或病理情况下的离子转运阻断剂法在加药反应之前加入某种通道的阻断剂（如Cl-通道阻断剂——DPC等）对组织进行一段时间的孵育，然后再加药，或在加药反应到高峰的时候再加阻断剂，看此时药物的反应是否会被抑制。离子替代法把正常K-H溶液中的某种离子替换掉（如Cl-用葡萄糖酸根替代），看此时加药后的反应比起在正常K-H中的反应是否有变化。打孔法在细胞两侧先加入某种离子浓度不相同的溶液（如做K+导就在顶膜侧加入高K+，基膜面加入低K+溶液），然后有目的性地在细胞的某侧加入打孔剂（如制霉毒素，两性霉素等），将该侧打穿，使该侧外界与细胞内相通（即细胞内液与该侧外溶液相同），待其稳定后，再加入药物，看此时是否能引起进一步的反应。常见的离子通道Na+通道amiloride:是特异性Na+通道阻断剂,对于高度Na+选择性的通道阻断效果非常好,它对于Na+/H+及Na+/Ca2+交换器也同样有阻断作用。Cl-通道CFTR(cAMP激活Cl-通道)：glibenclamide,CFTRi172Ca2+激活Cl-通道：DIDSDPC为非选择性的Cl-通道阻断剂常见的离子通道K+通道Ba2+(如BaCl2):为非选择性的K+通道阻断剂；TEA:为基底膜Ca2+激活K+通道阻断剂；其他K+通道阻断剂还有293B、ChTX等。Ca2+通道在上皮细胞离子转运研究中,常用的调控剂有L-型Ca2+通道阻断剂,如nifedipine和verapamil。常见的离子通道其他通道ouabain为Na+-K+泵抑制剂bumetanide为Na+-K+-Cl-共转运体阻断剂DIDS为基底膜Na+-HCO3-共转运体和Cl-/HCO3-交换器抑制剂;forskolin为腺苷酸环化酶激活剂;MDL12330A为腺苷酸环化酶阻断剂;IBMX为磷酸二酯酶(PDE)抑制剂;Indomethacin为前列腺素合成酶抑制剂;TTX为黏膜下神经元阻断剂;BAPTA-AM为细胞内Ca2+螯合剂。小结短路电流(Isc)技术是由丹麦科学家Ussing及Zerahn在20世纪50年代根据电压钳制(voltageclamp)的原理开发出来的，它是研究上皮离子转运的有效技术之一。它不仅能被用于研究上皮正常或病理情况下的离子转运（Na+,Cl-等）等，而且能被用于药物对上皮离子通道作用的研究中，具有广阔的应用前景。相信随着科学技术的发展，这项技术会越来越完善，也将会在生物研究和药物开