双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因序列拼接和分析.ppt

*实验目的1、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原理，掌握DNA测序的基本方法；2、学会序列查询、核酸及蛋白质的同源性搜索和比对。*本文档共42页；当前第1页；编辑于星期日\11点30分DNA测序技术主要有两种方法，都是在20世纪70年代中期发明的。A.双脱氧链终止法（thechainterminationmethod），是通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链来读取待测DNA分子的顺序。B.化学降解法（chemicaldegradationmethod），是将双链DNA分子用化学试剂处理，产生切口，用同位素标记进行测序。一、DNA测序的方法*本文档共42页；当前第2页；编辑于星期日\11点30分1.Sanger双脱氧链终止法测序原理利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家F.Sanger等人于1977年发明的。*本文档共42页；当前第3页；编辑于星期日\11点30分基本原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子；利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP参入到寡核苷酸链的3’-末端。因为ddNTP3’不是-OH，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。*本文档共42页；当前第4页；编辑于星期日\11点30分*本文档共42页；当前第5页；编辑于星期日\11点30分2、具体操作：测序时分成四个反应,每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A,C,G,T核苷三磷酸（称为ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP）,然后进行聚合反应。在第一个反应中,ddATP会随机地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H,所以不能继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了。*本文档共42页；当前第6页；编辑于星期日\11点30分同理第二个反应产生的都是以C结尾的;第三个反应的都以G结尾,第四个反应的都以T结尾,电泳后就可以读出序列了.*本文档共42页；当前第7页；编辑于星期日\11点30分假如有一个DNA,互补序列是GATCCGAT,我们试着做一下:在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP,所以遇到G,T,C三个碱基时没什么问题,但遇到A时,掺入的可能是dATP或ddATP,比如已合成到G,下一个如果参与反应的是ddATP则终止,产生一个仅有2个核苷酸的序列:GA,否则继续延伸,可以产生序列GATCCG,又到了下一个A了.同样有两种情况,如果是ddATP掺入,则产生的序列是GATCCGA,延伸终止,否则可以继续延伸,产生GATCCGAT.将得到如下结果：1产生的都是以A结尾的片段:GA,GATCCGA。234产生的都是以C结尾的片段:GATC,GATCC产生的都是以G结尾的片段:G,GATCCG产生的都是以T结尾的片段:GAT,GATCCGAT*本文档共42页；当前第8页；编辑于星期日\11点30分制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。

即可得到测序结果：为GATCCGAT*本文档共42页；当前第9页；编辑于星期日\11点30分制备单链模板↓将单链模板与一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸↓将4种反应产物分别在4条泳道电泳↓根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列3、技术路线：*本文档共42页；当前第10页；编辑于星期日\11点30分4、高通量自动化测序DNA序列分析自动化包括两个方面的内容，一方面是指“分析反应”的自动化，另一方面是指“读片过程”的自动化。自动化的DNA序列分析，也是根据Sanger双脱氧链终止DNA测序法的基本原理发展起来的。*本文档共42页；当前第11页；编辑于星期日\11点30分自动化测序原理自动化测序类似于PCR反应，但只用一条引物，反应混合物中含有不同荧光标记的ddNTP与4种dNTP。由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基。产物条